研究目的近年来,随着城市居民生活节奏的加快、人口老龄化的迅速到来和体育运动的蓬勃发展,因运动系统损伤而引发的慢性疼痛正在逐渐成为影响居民健康生活和运动员职业生涯的主要医疗问题之一。经过多年临床研究发现,目前大多数难治性的非器质性病变疼痛均来源于骨骼肌系统,欧美临床医师称之为肌筋膜触发点。该疾病的发病机理一直以来是疼痛领域的一项研究重点,但至今还尚不清楚。Hubbard和Berkoff采用单极肌电图针在肌筋膜触发点处记录到高幅峰电位,并认为这种放电活动可能来源于异常的肌梭。而且前期我们课题组通过对慢性肌筋膜触发点针刺发现,静息下可以观察到几种峰值倒置的异常自发电位(PISP电位),与正常骨骼肌终板电位显著不同,因此我们也推测这些异常电位可能来源于肌梭内核链纤维和核袋纤维的放电,即肌梭放电。本研究将从H反射通路、肌梭Ramp-and-hold牵拉和肌梭药物干预角度深入探究肌筋膜触发点异常自发电位的来源。同时也拟通过对肌筋膜触发点周围肌梭组织形态学特征、肌梭内部蛋白和基因表达水平等的客观评估,为肌梭是否参与肌筋膜触发点的发病提供更多依据。而Simons提出假设,认为肌筋膜触发点的形成可能与运动终板病理性改变有关,那么就非常有价值去探索这一病理性的挛缩结节是否存在抗原性,因此本研究也拟通过肌筋膜触发点肌细胞离体培养,观察肌筋膜触发点处挛缩结节的存在情况,并试图通过iTRAQ蛋白质组学标记技术,筛选与慢性肌筋膜触发点疾病相关的特异蛋白,为今后肌筋膜触发点细胞的免疫生物学精准治疗提供新的研究方向。研究方法:132只七周龄SPF级雄性SD大鼠(体重220-250g),随机分为两组,其中肌筋膜触发点造模组82只,常规对照组50只。然后将造模组大鼠随机分为11组,其中前10组每组8只,分别用于H反射诱发(A1组)、Ramp-and-hold牵拉(A2组)、琥珀胆碱注射(A3组)、乙哌立松注射(A4组)、生理盐水注射(A5组)、空白药物干预(A6组)、肌梭形态观察(C1组)、肌梭内NT-3和TrkC蛋白表达水平检测(C2组)、肌梭内NT-3 mRNA和TrkC mRNA表达水平检测(C3组)和肌筋膜触发点离体细胞培养(E1组),最后1组2只大鼠用于蛋白质组学研究(E2组)。将对照组大鼠随机分为7组,其中前6组每组8只,分别用于H反射诱发(B1组)、Ramp-and-hold牵拉(B2组)、肌梭形态观察(D1组)、肌梭内NT-3和TrkC蛋白表达水平检测(D2组)、肌梭内NT-3mRNA和TrkC mRNA表达水平检测(D3组)和正常肌细胞离体培养(F1组),最后1组大鼠2只也用于蛋白质组学研究(F2组)。造模组采取对腓肠肌定点钝性打击结合离心运动的模式进行连续8周造模。造模结束后两组均正常饲养4周。12周结束后,检测肌筋膜触发点造模成功指标(即紧张带、局部抽搐反应和自发肌电活动),并在此基础上显露两组大鼠胫神经,以双极银电极刺激胫神经,以双极针电极记录腓肠肌肌筋膜触发点处肌电变化,进而分析两组大鼠H反射、M波和F波变化特点。其次,在观察到造模组大鼠PISP电位的基础上,通过悬挂不同负荷的砝码重复性刺激腓肠肌肌梭进行ramp-and-hold牵拉最后,观察PISP电位在牵拉前、ramp期、hold期和牵拉后的变化情况,并与对照组作比较。此外,在观察到造模组大鼠PISP电位的基础上,采用琥珀胆碱肌筋膜触发点肌内注射、乙哌立松肌筋膜触发点肌内注射和0.9%生理盐水肌筋膜触发点肌内注射方法,观察异常PISP电位的发生频率、去极化时间、最大波幅和最大振幅的变化情况,并与空白干预组作比较。然后,分别提取C1组肌筋膜触发点处骨骼肌和D1组非肌筋膜触发点处骨骼肌采用HE染色技术观察肌筋膜触发点细胞周围肌梭的形态结构变化,并与常规对照组作比较。分别提取C2组、C3组腓肠肌肌筋膜触发点、比目鱼肌、胫骨前肌和跖肌处骨骼肌进行NT-3和TrkC蛋白的免疫印迹学(Western Blot)实验和基因的聚合酶链式反应(PCR)实验,并与常规对照组研究进行比较。此外,分别提取E1组和F1组大鼠肌筋膜触发点处骨骼肌和非肌筋膜触发点处骨骼肌进行单根肌纤维离体培养实验,并对肌筋膜触发点组可能存在的挛缩结节施以不同浓度的乙酰胆碱酯酶干预,对非肌筋膜触发点细胞施以乙酰胆碱干预,观察各组肌细胞组织形态学变化。最后,采用iTRAQ蛋白质组学技术筛选肌筋膜触发点骨骼肌与正常骨骼肌之间的差异蛋白,并对各蛋白功能进行相关性分析和GO功能注释、KEGG通路注释的生物信息学分析。数据统计分析均采用PRISM软件5.01版进行分析,参数数据以均值和标准差表示,非参数数据以中位数和四分位间距表示。研究结果:(1)与非肌筋膜触发点相比,肌筋膜触发点处记录到较低的H反射电刺激阈值(0.35±0.04mA)、较低的M波潜伏期(0.35±0.04mA),但均无统计学差异(P>0.05).同时与非肌筋膜触发点相比,肌筋膜触发点处可以记录到较小的Mmax(4.28±1.27mV)、较大的 Hmax(中位数[四分位间距]:0.95[0.80,1.08]mV)、更大的Hmax/Mmax中位数[四分位间距]:0.21[0.16,0.40])和较短的H波潜伏期(4.60±0.89ms),且组间比较均具有统计学差异(P<0.05)。多次重复Ramp-and-hold牵拉刺激肌梭,观察到异常PISP电位的去极化时间为0.4～0.9ms,波幅为80～140μV,而对常规对照大鼠重复进行Ramp-and-hold牵拉未观察到异常PISP电位。牵拉的ramp期、hold期第1s、hold期第2s、hold期第3s和hold结束后第1s的异常PISP电位放电频率均显著高于ramp牵拉前1 s的异常PISP电位放电频率(P<0.01)。琥珀胆碱注入肌筋膜触发点后PISP电位波幅、振幅和波频先是出现一个短暂地下降,随后迅速升高,并在注射后51-70s内达到峰值,而自发性终板电位随着时间的延长波幅逐渐降低、频率逐渐变小,直至消失。乙哌立松注入后PISP电位波幅、振幅和波频均迅速下降,并且终板电位的波频、波幅也均显著降低,直至消失。在生理盐水组,除注入后即刻和注射后91-1OOs时间段内出现短暂地PISP电位波幅增加和波频升高的情况以外,其整个观察时间内与空白对照组相比PISP电位波幅、振幅和波频均未出现显著差异。(2)造模组出现多边形且部分凹陷梭囊结构的肌梭和大量异常肌筋膜触发点细胞,且两者之间距离很近。而在正常骨骼肌中肌梭梭囊与梭外骨骼肌纤维正常排列,梭囊呈圆形或椭圆形,无异常压迫或接近现象。Western Blot结果表明,与正常大鼠组相比,NT-3蛋白在MTrPs大鼠内外侧腓肠肌中的含量均表现为降低,且统计学差异显著(P<0.05)。与正常大鼠组相比,NT-3的受体TrkC蛋白在肌筋膜触发点大鼠内侧腓肠肌、趾肌和胫骨前肌中的含量均表现为降低,且统计学差异显著(P<0.05)。PCR研究结果表明,与正常大鼠组相比,NT-3mRNA在肌筋膜触发点大鼠内外侧腓肠肌、趾肌、胫骨前肌和比目鱼肌中的含量均表现为降低,且统计学差异均显著(P<0.05)。此外,与正常大鼠组相比,TrkCmRNA在肌筋膜触发点大鼠内外侧腓肠肌和趾肌含量也均表现为降低,且统计学差异均显著(P<0.05)。(3)通过对肌筋膜触发点骨骼肌纤维进行离体培养,骨骼肌处仍存在较大的挛缩结节,并且部分挛缩结节还发生了扭曲变形的现象。滴加不同浓度的乙酰胆碱酯酶干预后,触发点骨骼肌中挛缩结节均未见明显形态学变化。正常骨骼肌细胞滴加不同浓度的乙酰胆碱后,也未见正常骨骼肌发生显著性形态学改变。肌筋膜触发点造模组与正常对照组相比,共有50个表达差异蛋白质,其中表达量上调25个,表达量下调25个。研究结论:(1)通过H反射通路、肌梭Ramp-and-hold牵拉技术和肌梭药物干预方式,发现肌筋膜触发点大鼠脊髓中枢可能存在中枢敏化现象,Ia类传入神经兴奋性增高,肌梭敏感性增高。而肌筋膜触发点自发性电位中峰值倒置的峰电位与肌梭关系密切,即肌筋膜触发点的形成与肌梭之间可能存在密切关系。(2)慢性肌筋膜触发点的形成在组织形态学上严重影响了肌梭的形态结构和功能,也诱发了受累肌和多块关联肌肌梭内NT-3、受体TrkC蛋白和基因的显著性下调。(3)肌筋膜触发点细胞可以在离体情况下继续维持挛缩形态,但尚不确定挛缩结节的恢复是否与乙酰胆碱有关。此外,肌筋膜触发点骨骼肌与正常骨骼肌之间的差异蛋白主要体现在与肿瘤疾病、能量代谢紊乱、肌细胞蛋白合成与结合、肌肉收缩、突触、纤维蛋白原复合物和类风湿关节炎等方面有关。