蛋白酪氨酸激酶PDGFRβ、EGFR2和c-Src与蛋白酪氨酸磷酸酶1B在毕赤酵母中的共表达

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蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)两种酶对蛋白质的磷酸化调控是维持细胞生理平衡状态所必须的。在毕赤酵母中共表达酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶1B能够解决细胞因过度表达酪氨酸激酶而对自身带来的毒性这一难题,有利于酪氨酸激酶的表达。本文构建的重组PTP1B毕赤酵母表达菌株中,PTP1B基因末端连接了蓝色荧光蛋白基因(BFP)和过氧化物酶体定位信号1(SKL)序列,构建了四种表达载体pAG32S-PTP1B、pAG32S-PTP1B-SKL、pAG32S-BFP-PTP1B和pAG32S-BFP-PTP1B-SKL,并将其分别转化到酵母宿主菌GS115中。该重组基因在诱导型AOX1启动子控制下表达。  EGFR-2、PDGFRβ和c-Src三种酪氨酸激酶在信号转导中具有重要功能,是公认的治疗恶性肿瘤的重要靶点。我们将EGFR-2、PDGFRβ和c-Src基因克隆到pPIC3.5K质粒中,构建了表达载体pPIC3.5-GFP-EGFR2-SKL、pPIC3.5-GFP-PDGFRβ-SKL和pPIC3.5-GFP-c-Src,并将其分别转化到含PTP1B基因的重组表达菌株及GS115菌株中,得到15株表达融合蛋白的毕赤酵母菌株。在AOX1启动子调控下,分别产生N末端含有绿色荧光蛋白标记(GFP)的EGFR-2、PDGFRβ和c-Src三种蛋白。为了避免对宿主细胞潜在的负作用,我们在EGFR-2和PDGFRβ蛋白的C末端加了过氧化物酶体定位信号1(SKL)。本实验研究了PTP1B共表达对EGFR-2、PDGFRβ和c-Src异源表达的影响。  将EGFR-2、PDGFRβ和c-Src表达载体转化到重组PTP1B基因毕赤酵母GS115菌株和GS115野生株中,利用G418进行高拷贝菌株筛选,在摇瓶中诱导表达各基因,并对两种毕赤酵母中酪氨酸激酶的表达活性进行比较。通过镍柱亲和纯化EGFR-2、PDGFRβ和c-Src目的蛋白。通过Western blot检测,EGFR-2、PDGFRβ和c-Src蛋白分子量分别约为93 kDa、89 kDa和92 kDa。ELISA检测表明,目的蛋白具有酪氨酸激酶活性。本实验证明,在毕赤酵母中共表达蛋白酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶时,酪氨酸激酶的活性比单独表达酪氨酸激酶时的活性要高,并且酪氨酸激酶及酪氨酸磷酸酶都定位在过氧化物酶体时,蛋白酪氨酸激酶的表达量最高。本研究中表达的EGFR-2、PDGFRβ及c-Src具有激酶催化活性,可以作为靶标蛋白用于抗肿瘤药物的筛选。
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