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目的有机磷化合物(Organophosphorus,OPs)在农业、工业中有着非常广泛的应用。据统计全世界每年约有300万人暴露于有机磷化合物。部分有机磷化合物能够诱导迟发性神经病变,称为有机磷化合物诱导的迟发性神经病(Organophosphorus-induced delayed neuropathy,OPIDN)。三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)是最早被鉴定为能够诱导人类OPIDN的有机磷化合物。OPIDN的病理学特征为Wallerian样变性,表现为神经管和神经丝的丢失,线粒体和囊泡等的堆积,这提示可能存在异常的蛋白质降解机制。课题组前期通过TOCP染毒整体动物和离体细胞均发现细胞中自噬活性发生改变,提示自噬在OPIDN的发生过程中发挥一定作用。到目前为止,OPIDN发病机制的研究尚不透彻,自噬在OPIDN中发挥的具体作用及其机制并不明确。在本研究中我们利用TOCP染毒分化后的野生型和自噬缺陷型(Atg7-/-)小鼠神经瘤母细胞(Neuro-2a,N2a),作为在该研究中有机磷神经毒性的体外模型,并利用暴露于TOCP的罗曼母鸡作为体内模型,来探讨自噬在TOCP引起Neuro-2a细胞轴突和细胞体损伤中的作用,以期揭示自噬与TOCP导致的神经细胞损伤间的内在关系。方法1.建立TOCP染毒N2a细胞模型野生型N2a细胞和自噬缺陷型(Atg7-/-)N2a细胞贴壁后,加入含10μM视黄酸(Retinoic acid,RA)的2%血清培养液诱导分化48h。分别使用0 μM、5μM、10 μM的TOCP处理诱导分化成功的两种细胞,培养24h后到达染毒终点。2.形态学观察细胞经TOCP处理24 h后,每组中随机选取20个视野进行显微镜下观察(200 X),并拍照记录。使用TCapture记录每个视野中10个细胞的轴突长度,进行数据分析。3.细胞线粒体膜电位检测使用JC-1线粒体膜电位测定试剂盒检测N2a细胞的线粒体膜电位。将野生型N2a细胞和Atg7-/-细胞用不同浓度TOCP处理后,在37℃下加入JC-1染色工作液(5 μg/mL)孵育20分钟后用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤。荧光显微镜下观察染色细胞并拍照。荧光酶标仪检测JC-1单体(绿色荧光,激发光490 nm,发射光530 nm)和JC-1聚合物(红色荧光,激发光525 nm,发射光590 nm)荧光强度。4.蛋白免疫印迹实验利用RIPA裂解液提取TOCP处理的野生型N2a细胞和Atg7-/-细胞全蛋白,检测Wallerian变性相关蛋白NMNAT、SARM1、DLK等蛋白的表达,以及calpain降解系统、内质网应激、程序性坏死相关蛋白的表达变化。利用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction试剂盒提取细胞核蛋白样品,检测内质网应激相关核因子蛋白表达水平。5.实时荧光定量PCRTRIzol法提取不同剂量处理的野生型N2a细胞和Atg7-/-细胞总RNA,逆转录成cDNA,利用UPL荧光探针和实时荧光定量PCR检测抗氧化基因的相对表达水平。6.动物实验建立TOCP诱导动物OPIDN模型:选取30只健康成年罗曼母鸡,适应性喂养3天后,随机均分为5组,分别为对照组、1D、5D、10D、21D组。一次性经口灌胃进行TOCP染毒,灌胃剂量为750mg/kg,对照组不做处理。每天观察并记录动物双下肢的活动情况和步态变化,按照八级评分标准对母鸡OPIDN临床症状的进展进行评分。在TOCP染毒1天、5天、10天、21天时,断头处死相应组别的动物,在冰袋上迅速取出动物的脊髓、胫神经等部位。建立OPIDN干预动物模型:另取30只健康成年罗曼母鸡,适应性喂养3天后,随机均分为6组,分别为对照组、0D、1D、5D、10D、21D组。对照组不做任何处理,其余组别提前24h皮下注射PMSF,剂量为90mg/kg,再一次性经口灌胃进行TOCP染毒,灌胃剂量为750mg/kg。每天观察并记录动物双下肢的活动情况和步态变化,按照八级评分标准对母鸡OPIDN临床症状的进展进行评分。在TOCP染毒0天、1天、5天、10天、21天时,断头处死相应组别的动物,在冰袋上迅速取出动物的脊髓、胫神经等部位。提取脊髓、胫神经组织总蛋白,利用蛋白免疫印迹实验检测Wallerian变性相关蛋白的表达水平。结果1.Atg7基因敲除对TOCP诱导的N2a细胞轴突损伤的影响(1)TOCP处理对N2a细胞轴突的影响:TOCP处理引起分化的N2a细胞的轴突明显缩短,轴突损伤随着染毒剂量的升高而增加。Atg7基因敲除对TOCP诱导N2a细胞产生的轴突损伤具有保护作用。(2)促轴突存活因子与促轴突损伤因子蛋白表达的变化:TOCP染毒后,野生型细胞和Atg7-/-细胞中NMNAT2和SCG10的蛋白水平均显著下降,而SARM1和p-CRMP2的蛋白表达含量均呈现剂量依赖性增加。在相同剂量的TOCP暴露下,Atg7-/-细胞中NMNAT2和SCG10蛋白的表达含量均高于野生型细胞,SARM1蛋白的表达均低于野生型细胞。结果提示Atg7基因敲除能够减缓TOCP诱导N2a细胞中促轴突存活因子水平的下降和促轴突损伤因子水平的升高。(3)DLK-MKK4-MAPK信号通路分子蛋白表达的变化:DLK和p-MKK4的蛋白水平在野生型细胞和Atg7-/-细胞中均明显增加,且p-P38和p-ERK1/2蛋白表达也增多。结果提示TOCP处理后N2a细胞中DLK-MKK4-MAPK信号通路被激活。(4)动物模型中Wallerian变性相关分子蛋白表达的变化:TOCP模型组的动物自第五天起,实验组动物双下肢开始出现轻微变化,行走偶有摇晃。OPIDN的症状进展迅速,动物双下肢力量越来越弱,行走协调度变差,脚步成外八字形,摇晃逐渐加剧甚至出现跌倒。到第15天时所有动物都完全瘫痪,此状态一直持续直到实验结束,未出现好转或恢复。对照组动物在实验期间未出现任何异常变化。PMSF干预组动物在实验期间站立和行走状态正常,未出现OPIDN症状。TOCP染毒模型脊髓与胫神经中p-MKK4(或SARM1)、p-JNK的水平均呈现时间依赖性的增加。,而在PMSF干预组脊髓和胫神经中p-MKK4、p-JNK的蛋白水平各组之间差异不具有统计学意义。(5)Calpain降解系统蛋白表达水平的变化:10μMTOCP染毒后,两种细胞中m-calpain和μ-calpain的蛋白表达量均上升,Calpastain蛋白的表达则呈现剂量依赖性的降低。结果支持TOCP诱导N2a细胞中calpain降解系统激活。2.Atg7基因敲除对TOCP诱导的N2a细胞体损伤的影响(1)细胞线粒体膜电位的变化:TOCP染毒引起两种细胞中红色荧光强度与绿色荧光强度的比值明显下降,线粒体膜电位下降,提示线粒体受到损伤。与野生型细胞相比,Atg7基因敲除能显著减轻TOCP诱导的N2a细胞线粒体损伤。(2)细胞内质网应激相关分子表达水平的变化:TOCP处理后,ATF6、CHOP在两种细胞中均呈现剂量依赖性增加。ATF4、p-eIF2a在野生型N2a细胞,10μM TOCP染毒组中的表达水平比对照组显著升高,但在Atg7-/-细胞中没有明显变化。(3)抗氧化相关分子表达的变化:给予TOCP染毒后N2a细胞中抗氧化基因的mRNA的表达均呈现剂量依赖性增加,而且在Atg7-/-细胞中mRNA的表达水平明显高于野生型N2a细胞。(4)细胞程序性坏死相关分子表达水平的变化:在野生型N2a细胞中RIP1和p-MLKL的表达水平都随TOCP剂量增大而升高,均高于在Atg7-/-细胞中的表达水平。给予TOCP后,N2a细胞中程序性坏死被激活,Atg7基因敲除对TOCP诱导的程序性坏死具有保护作用。结论1.TOCP诱导神经细胞产生轴突损伤,Atg7基因敲除对TOCP诱导神经细胞轴突和细胞体的损伤具有保护作用。2.TOCP诱导N2a细胞轴突损伤,与Wallerian变性中促轴突存活因子的消耗、促轴突损伤因子的增加有关,与Wallerian变性上游通路和calpain降解系统的激活有关。Atg7基因敲除能够缓解促轴突存活因子的消耗和促轴突损伤因子的增加。3.TOCP诱导N2a细胞胞体损伤,与诱导细胞内氧化应激、内质网应激、线粒体损伤、激活程序性坏死反应有关。Atg7基因敲除能够缓解TOCP诱导细胞产生的氧化应激、内质网和线粒体的损伤。