戊糖片球菌产酶对发酵鱼糜凝胶性能的影响

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发酵鱼糜制品因其营养价值高、风味独特、保藏性能好以及安全性优等特点具有广阔的市场前景。凝胶性能是影响发酵鱼糜制品品质的重要特性指标,鱼糜凝胶形成机理已成为学者们的一个研究热点。微生物发酵鱼糜的凝胶形成机理较为复杂,其中微生物发酵产酸对鱼糜凝胶性能的影响已经取得了突破性进展,但微生物在发酵过程中除了产酸,还会代谢生成酶等物质,代谢产物对鱼糜凝胶性能的影响不容忽视。目前关于微生物产酶对发酵鱼糜凝胶性能的影响研究甚少。所以本论文选用一株广泛运用于发酵鱼糜制品的戊糖片球菌,从戊糖片球菌产酶角度研究其对发酵鱼糜凝胶性能的影响,为系统完善发酵鱼糜凝胶形成机理提供理论依据,对进一步优化发酵鱼糜生产工艺,提高鱼糜品质具有现实意义。首先对戊糖片球菌产酶能力、酶分离纯化及酶学性质进行研究。通过测定不同接种量以及不同时间下的酶活力确定戊糖片球菌产酶的最佳条件。提取粗酶液通过饱和硫酸铵溶液盐析,阴离子交换层析(DEAE-Sepharose Fast Flow)以及凝胶过滤层析(SephadexG-75)进行分离纯化。经SDS-PAGE电泳测定蛋白酶分子量后对分析酶学性质,探讨蛋白酶的最适宜温度和热稳定性、最适宜pH和pH稳定性、金属离子及抑制剂对蛋白酶的影响等。结果表明:戊糖片球菌的发酵液中提取的酶在酸性条件下有活力,且发酵时间控制在20小时,接种量2%时产酶能力较强。最佳硫酸铵盐析饱和浓度为60%,经分离纯化得到的蛋白酶分子量为37kDa。研究蛋白酶的酶学性质发现蛋白酶的最适温度为35℃,在20-40℃下保持稳定;最适pH为4.0,在pH4.0-7.0环境中相对稳定;金属离子Ca2+对酶有激活作用,Zn2+、Mg2+、Fe3+则表现出抑制作用;抑制剂SDS、EDTA对蛋白酶抑制作用明显。其次研究了蛋白酶对鲢鱼鱼糜的蛋白质作用以及凝胶性能的影响。将蛋白酶添加到模拟酸化体系中,通过测定TCA-溶解肽含量、非蛋白氮(NPN)以及游离氨基酸分析蛋白酶对鱼糜的蛋白质发生降解作用以及研究其对凝胶强度的影响。结果表明:加酶后鱼糜样品中低分子肽、NPN以及游离氨基酸含量都有一定程度的升高,添加蛋白酶后的鱼糜凝胶劣化程度增大,在96h时的凝胶强度仅为4h的32.9%。最后从分子水平上进一步研究了鱼糜在蛋白酶作用下的凝胶劣化。通过测定低pH值条件下肌动球蛋白的浊度、粒径、TCA-溶解肽含量的变化分析蛋白酶对肌动球蛋白的降解,以及通过分析圆二色谱、紫外吸收及其二阶导以及内源荧光探讨酶对蛋白结构的影响。结果表明:加入蛋白酶的样品浊度降低、粒径变小以及TCA-溶解肽含量增加,蛋白的聚集性变小。而圆二色谱中-helix在222nm处特征峰明显,紫外吸收二阶导光谱蓝移,内源荧光强度增加说明肌动球蛋白的二级及三级结构都有一定程度的改变。
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