在高等植物的双受精过程中,精-卵细胞融合形成合子（受精卵）,合子经不同时长的休眠后启动分裂,继而经过不同发育阶段发育为成熟胚胎,这一发育过程是个体发育的起点。合子和胚胎经过一系列极其复杂的、精确的、且高度有序的分裂和分化过程,最终发育为成熟胚胎,其间受到一系列分子调控。在此过程中,叶绿体由原质体发育而来,其中产生叶绿素。与叶绿体相关的基因突变通常会导致异常的胚胎发育,说明叶绿体在胚胎发育过程中起着重要作用,但具体的机制目前仍不清楚。植物PORR（Plant Organelle RNA Recognition）蛋白为一种RNA结合蛋白,含有植物细胞器RNA识别结构域。拟南芥和玉米中均包括15个同源基因,而水稻中有17个同源基因。大多数PORR蛋白家族定位于叶绿体或线粒体,表明具有该结构域的蛋白在这两种细胞器中具有重要的功能。到目前为止,PORR蛋白参与许多植物生长发育,例如胚胎发育、胚乳发育、光合作用、细胞色素合成等。PORR蛋白作为一种RNA结合蛋白,主要参与Group II内含子剪接,进而发挥着重要的功能。为了揭示拟南芥叶绿体蛋白EM33（EMBYRO-DEFECTIVE 33）的功能,本研究以EM33基因的T-DNA插入突变体、胚胎特异表达基因ABI3（abscisic acid（ABA）-insensitive）为启动子的部分回复植株为实验材料,通过分子生物学、遗传学、细胞生物学以及生物信息学等多种技术和方法,研究了EM33基因在胚胎和叶绿体发育中的功能,并重点研究了EM33对叶绿体Group II内含子的剪接作用,获得的主要研究结果如下:1.对拟南芥EM33基因启动子启动绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）和GUS（β-glucuronidase,葡萄糖醛酸糖苷酸酶）的转基因植株进行观察,发现其在不同的组织广泛表达,特别是新生幼叶和绿色胚胎中表达较强。此外,对萌发6天的野生型幼苗进行黑暗处理24小时,检测EM33基因的表达水平,发现EM33基因的表达量下降至对照组的一半;恢复幼苗光照24小时后,其表达可恢复至对照组水平,表明光影响拟南芥EM33基因的表达。对纯合突变体胚胎进行超薄结构的观察,发现叶绿体的类囊体膜缺失,从而影响胚胎继续发育,表明拟南芥EM33影响胚胎发育过程。利用q RT-PCR技术,以野生型为对照组,检测拟南芥纯合突变体白化胚珠中与胚胎发育和叶绿体功能相关的基因表达情况,发现与茎顶端分生组织、子叶形成、下胚轴形成、光合系统I、光合系统II、细胞色素b6/f复合物和ATP合成酶相关的基因表达出现异常,表明拟南芥EM33基因的突变影响胚胎发育和叶绿体功能。2.利用拟南芥胚胎特异启动子ABI3,获得了具有部分回复的转基因杂合突变体植株,称为em33-2/+pro ABI3::EM33-GFP。观察发现,授粉后5天em33-2/+植株角果,发现白化胚珠比较饱满且透亮,授粉7天时白化胚珠皱缩,整个角果中胚珠败育率为25.69%。然而,在em33-2/+pro ABI3::EM33-GFP植株授粉5天角果中白化胚珠与突变体中的白化胚珠基本一致,授粉7天一部分白化胚珠仍然饱满,另一部分白化胚珠出现皱缩,成熟的角果中种子的败育率下降到8.7%,因此称为部分回复植株。将部分回复植株的em33-2/+pro ABI3::EM33-GFP种子铺在1/2 MS培养基上萌发并形成幼苗,当幼苗生长至7天时,发现em33-2/-pro ABI3::EM33-GFP幼苗子叶为黄色,叶片比野生型幼苗窄小。随着真叶形成和发育,发现em33-2/-pro ABI3::EM33-GFP幼苗真叶为浅绿色,并且整株幼苗较小。当生长21天时,野生型已有第二对真叶,而em33-2/-pro ABI3::EM33-GFP幼苗只有第一对真叶或刚生长出第二对真叶。对胚胎叶绿素自发荧光的观察发现,与野生型对照组相比,回复植株中纯合突变体胚胎叶绿素含量下降;对种子萌发7和14天的幼苗子叶或真叶叶绿素含量的测定,结果显示叶绿素含量也明显下降。这一结果表明,EM33基因的突变影响拟南芥胚胎发育和幼苗形成过程中叶绿素的合成,由此导致幼苗无法继续生长和发育,最终死亡。3.利用激光共聚焦技术,对蛋白亚细胞水平定位检测表明,拟南芥EM33蛋白定位于叶绿体中,表明该蛋白确实为叶绿体蛋白。生物信息学分析表明,EM33蛋白属于PORR蛋白家族,含有植物细胞器RNA识别结构域,该蛋白在高等植物中较为保守。大多数PORR蛋白家族定位于叶绿体或线粒体中,推测具有该结构域的蛋白可能在两种细胞器中具有重要的功能。分析表明,WTF1（what’s this factor?）定位于玉米叶绿体,功能缺失后导致一半叶绿体Group II内含子剪接缺陷。拟南芥中包含15个PORR同源基因,系统进化树的分析显示,EM33与WTF1聚类在一个小分支,表明EM33功能可能与WTF1比较相似。通过半定量PCR检测显示,从拟南芥叶绿体中20个Group II内含子剪接情况,发现当EM33基因功能缺失后,ndh A、atp F、rps12-2、rpl2、ycf3-1和ycf3-2这6个Group II内含子剪接存在缺陷,表明该基因可能对这6个Group II内含子的剪接发挥着重要的作用。深入的研究正在进行中。4.玉米中WTF1存在于Group II内含子核糖核蛋白颗粒中,与RNase III结构域蛋白直接相互作用形成异源二聚体。经过酵母双杂交实验筛选与EM33存在互作关系的蛋白过程中,结果发现At EM33能与At CFM2存在互作关系,但需要采用其他研究手段进一步的验证。5.另外,对拟南芥编码定位于叶绿体PPR蛋白的基因AES（Albino embryo and seedling）进行了靶基因回复实验的初步研究。通过农杆菌介导的拟南芥浸花转基因技术获得psb T、psb H、pet B和pet D各基因转录本正常积累的转基因植株,观察其角果表型和统计分析白化胚珠的败育率,发现转基因植株角果中仍存在白化胚珠,且白化胚珠的比例均为25%左右;结果表明psb T、psb H、pet B和pet D这4个基因单个转录本正常积累时,并不能回复aes/+突变体的表型。