一、目的:黑色素瘤恶性程度非常高,确诊时已经发现有远处转移。已经有研究证实,在黑色素瘤中上皮间质转化和肿瘤的侵袭转移关系密切。另外有研究表明缝隙连接蛋白Cx43和缝隙连接通讯功能的增强抑制恶性肿瘤的上皮间质转化的过程。在肿瘤微环境中,肿瘤相关巨噬细胞的极性转化及细胞因子的分泌促进肿瘤的上皮间质转化。缝隙连接通讯功能提高时增加巨噬细胞的抗原递呈能力,缝隙连接与免疫密切相关。在实验室前期研究中发现,薯蓣皂苷可以提高缝隙连接蛋白表达及通讯功能。本研究采用小鼠黑色素瘤B16细胞,肿瘤相关巨噻细胞RAW264.7细胞和C57BL/6小鼠作为研究对象,探讨薯蓣皂苷在提高缝隙连接通讯功能的基础上对小鼠黑色素瘤杀伤和转移,以及在肿瘤相关巨噬细胞模型下薯蓣皂苷治疗小鼠黑色素瘤的作用机制。二、方法:(1)薯蓣皂苷对缝隙连接蛋白及功能和上皮间质转化的影响1、MTT法检测0～8μM薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤B16细胞生长的影响,以确定用于研究后续实验的Dio浓度。RT-PCR及Western bolt检测Dio和RA对B16细胞Cx43基因和蛋白的影响,采用相对定量方法分析Cx43mRNA水平和蛋白水平,用免疫荧光的方法检测Dio和RA治疗B16细胞48 h后Cx43蛋白的表达。用激光共聚焦显微镜(Confocal)及流式细胞仪检测Dio和RA作用B16细胞48 h后GJIC的功能。2、划痕方法和transwell实验检测薯蓣皂苷对B16细胞侵袭和迁移能力的影响。3、AmpliteTM Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit 试剂盒检测薯蓣皂苷对MMPs活性的影响。4、Dio和RA对B16细胞治疗48 h后,使用胰酶消化细胞后,收集消化下来的细胞,用RIPA加PMSF裂解细胞后提取处理过的总蛋白并且定量。采用Western bolt检测上皮间质转化蛋白 E-cadherin,N-cadherin,snail1,vimentin,β-catenin 及肿瘤干细胞蛋白sox-2,oct3/4,nanog的表达情况。(2)薯蓣皂苷抑制小鼠黑色素瘤转移的机制探讨1、Confocal检测过表达Cx43和突变型Cx43质粒的转染效率。Western bolt及免疫荧光的方法检测过表达Cx43和突变型Cx43转染48 h后Cx43蛋白的表达从而确定转染是否成功。划痕标记荧光染料示踪技术检测过表达Cx43和突变型Cx43转染B16细胞24 h后荧光传输情况。从而确定质粒转染后对细胞功能是否起作用。2、划痕方法和transwell实验检测缝隙连接通讯功能改变对B16细胞侵袭和迁移能力的影响。3、AmpliteTM Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit 试剂盒检测缝隙连接缝隙连接通讯功能改变对MMPs活性的影响。4、Western bolt检测过表达Cx43,突变型Cx43转染48 h后,检测上皮间质转化蛋白 E-cadherin,N-cadherin,snaill,vimentin,β-catenin 的表达情况。5、在缝隙连接通讯功能被阻断的B16细胞上给予薯蓣皂苷处理48 h后,检测缝隙连接蛋白 Cx43,上皮间质转化蛋白 E-cadherin,N-cadherin,snail1,vimentin,β-catenin的表达情况。6、薯蓣皂苷作用B16细胞48 h后,Western bolt检测维甲酸受体蛋白RXRα,RARα,RARβ,RARγ的表达情况。(3)薯蓣皂苷对肿瘤相关巨噬细胞RAW264.7的作用1、MTT法检测0～8 μM薯蓣皂苷对肿瘤相关巨噬细胞RAW264.7细胞杀伤的作用。薯蓣皂苷(1 μM及2 μM)对RAW264.7细胞治疗48 h后,Western bolt检测缝隙连接蛋白Cx43水平,激光共聚焦显微镜检测薯蓣皂苷作用RAW264.7细胞48 h后与B16细胞共培养以及过表达Cx43和突变型Cx43作用RAW264.7细胞48 h后与B16细胞共培养,巨噬细胞吞噬B16细胞的能力。2、流式细胞仪检测薯蓣皂苷和脂多糖(LPS)作用RAW264.7细胞48h后,肿瘤相关巨噬细胞表型(F4/80),M1 型(CD68,CD86,NOSi),M2 型(CD206,CD209)变化。3、ELISA检测薯蓣皂苷作用RAW264.7细胞48 h后,分泌细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6变化。4、划痕方法和transwell实验检测RAW264.7细胞条件培养液(薯蓣皂苷(0,1μM,2 μM)和LPS(1μg/mL)作用RAW264.7细胞48 h后,弃培养基更换新鲜无药RPMI1640培养基继续培养24 h后,收集培养基离心取上清即为条件培养液)作用小鼠黑色素瘤B16细胞对侵袭及迁移能力的影响。5、取条件培养液作用小鼠黑色素瘤B16细胞48 h后,提蛋白及定量。采用Western bolt检测缝隙连接蛋白Cx43,上皮间质转化蛋白E-cadherin,N-cadherin,snail1,vimentin,β-catenin及肿瘤干细胞蛋白sox-2,oct3/4,nanog的表达情况。(4)建立C57BL/6小鼠肿瘤转移模型研究薯蓣皂苷对肺转移的影响建立小鼠黑色素瘤B16细胞主动肿瘤转移模型和肿瘤被动转移模型,肿瘤主动转移模型:将小鼠黑色素瘤B16细胞3×105个通过尾静脉注射到小鼠体内,第二天开始随机分组,实验分组为模型组,低剂量组和高剂量组,每组C57BL/6的样本量为10只,共30只。薯蓣皂苷开始灌胃给药,每天给药1次,给药18天。肿瘤被动转移模型:将小鼠黑色素瘤B16细胞4×105个接种到小鼠背部。当长出肿瘤时,随机分组,实验分组为模型组,低剂量组和高剂量组,每组C57BL/6的样本量为12只共36只。以薯蓣皂苷30 mg/kg和60 mg/kg浓度开始灌胃给药,每天给药1次。给药结束后,处死小鼠,取材一部分冻存于-80℃,一部分4%多聚甲醛固定。采用免疫组化的方法检测缝隙连接蛋白Cx43,上皮间质转化蛋白E-cadherin,N-cadherin的表达情况。三.结果:(1)薯蓣皂苷对缝隙连接蛋白及功能和上皮间质转化的影响1、MTT结果显示薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤B16细胞有杀伤作用,半数杀伤药物浓度为4.21 μM。RT-PCR,Western bolt,激光共聚焦显微镜检测薯蓣皂苷对B16的作用结果显示,与空白对照组相比,薯蓣皂苷组上调缝隙连接Cx43的基因及蛋白水平的表达。Confocal及流式细胞仪检测薯蓣皂苷对B16的作用48h后结果显示,与空白对照组相比,随着浓度的增加,薯蓣皂苷提高B16细胞的缝隙连接通讯功能。2、划痕方法及transwell实验检测薯蓣皂苷对B16细胞的作用48 h后结果显示,与空白对照组相比,随着浓度的增加,薯蓣皂苷降低B16细胞的侵袭及迁移的能力。3、AmpliteTM Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit 试剂盒检测薯蓣皂苷对B16细胞的作用48 h结果显示,与空白对照组相比,随着浓度的增加,薯蓣皂苷能显著性降低MMPs的活性。4、Western bolt检测薯蓣皂苷作用B16细胞48 h结果显示,与空白对照组相比,上皮间质转化蛋白表达情况显示,薯蓣皂苷能显著上调E-cadherin的蛋白表达水平,下调N-cadherin,snail1,vimentin,β-catenin的蛋白表达水平。肿瘤干细胞蛋白表达情况显示,随着浓度的增加,薯蓣皂苷能显著性降低oct3/4,sox-2及nanog表达水平。(2)薯蓣皂苷通过激活维甲酸受体通路来上调Cx43从而抑制肿瘤转移1、用激光共聚焦显微镜检测过表达及突变型Cx43的转染效率为70%左右。瞬时转染过表达及突变型Cx43质粒48 h后,采用免疫荧光及Western bolt的方法检测结果显示,质粒转染成功能够上调缝隙连接蛋白Cx43的表达。划痕标记荧光染料示踪技术检测过表达Cx43和突变型Cx43转染B16细胞24 h后,过表达Cx43增强B16的缝隙连接通讯功能,突变型Cx43阻断缝隙连接通讯功能。2、划痕及transwell实验结果显示,与空质粒组相比,过表达Cx43抑制B16细胞的侵袭和迁移能力,突变型Cx43增强B16细胞的侵袭和迁移能力。3、MMPs活性检测试剂盒检测过表达Cx43和突变型Cx43对B16细胞的作用结果显示,与空质粒组相比,过表达Cx43能显著性降低MMPs活性,突变型Cx43能显著性提高MMPs活性。4、Western bolt检测过表达Cx43和突变型Cx43对B16细胞的作用结果显示,与空质粒组相比,上皮间质转化蛋白表达情况显示,过表达Cx43能显著上调E-cadherin的蛋白表达水平,显著下调snail1,vimentin的蛋白表达水平,同时下调N-cadherin,β-catenin表达水平,显著性差异。与之相反,上皮间质转化蛋白表达情况显示,突变型Cx43能显著下调E-cadherin的蛋白表达水平,显著上调snail1,vimentin,N-cadherin,β-catenin 的蛋白表达水平。5、Western bolt检测突变型Cx43的B16细胞薯蓣皂苷作用48 h结果显示,与空质粒组相比,薯蓣皂苷能显著上调正常缝隙连接蛋白Cx43蛋白的表达。与突变型Cx43组相比,薯蓣皂苷药物作用后,随浓度的增加,上皮间质转化蛋白表达情况显示,E-cadherin 的蛋白表达显著上调,snail1,vimentin,N-cadherin,β-catenin 的蛋白表达显著下调。6、Western bolt检测薯蓣皂苷作用B16细胞48 h后结果显示,随着浓度的增加,维甲酸受体蛋白RXRα表达显著下降,RARα,RARβ,RARγ表达显著升高。考虑薯蓣皂苷上调Cx43可能是通过维甲酸受体通路起作用。(3)薯蓣皂苷对肿瘤相关巨噬细胞的抗肿瘤作用1、MTT检测薯蓣皂苷对RAW264.7细胞的生长作用,结果显示,与空白组相比,薯蓣皂苷对RAW264.7细胞的杀伤作用不明显。Western bolt检测薯蓣皂苷作用于RAW264.7细胞48 h上调Cx43蛋白的表达。激光共聚焦显微镜检测薯蓣皂苷处理RAW264.7细胞与B16细胞共培养,结果显示,随着浓度增加,薯蓣皂苷增加RAW264.7细胞的吞噬能力。过表达Cx43与突变型Cx43分别与B16细胞共培养结果显示,过表达Cx43增加RAW264.7细胞的吞噬能力,突变型Cx43降低RAW264.7细胞的吞噬能力,以上结果表明薯蓣皂苷通过上调Cx43提高RAW264.7细胞的吞噬能力。2、流式细胞仪检测薯蓣皂苷作用于RAW264.7细胞48 h,结果显示,与对照组相比,随着浓度的增加,M1型标记物NOSi,CD86,CD68表达增加,M2型标记物CD206,CD209表达下降。薯蓣皂苷使RAW264.7细胞由M2型向M1型转化。3、ELISA检测薯蓣皂苷作用于RAW264.7细胞48 h,结果显示,薯蓣皂苷上调细胞因子 TNF-α,IL-1β,IL-6。4、划痕和transwell实验检测RAW264.7细胞条件培养液作用于B16细胞48 h后,结果显示,与空白对照组相比,薯蓣皂苷组RAW264.7细胞培养液降低B16细胞的侵袭及迁移能力。5、Western bolt检测RAW264.7细胞条件培养液作用于B16细胞48 h后结果显示,与空白对照组相比,上皮间质转化蛋白表达情况显示,随着浓度的增加,薯蓣皂苷组RAW264.7细胞培养液能显著上调Cx43的蛋白表达,显著上调E-cadherin的蛋白表达水平,下调N-cadherin,snail1,vimentin的蛋白表达水平,对β-catenin蛋白表达作用不明显。肿瘤干细胞蛋白表达情况显示,随着浓度的增加,薯蓣皂苷组RAW264.7细胞培养液能显著性降低sox-2,nanog,oct3/4蛋白表达水平。(4)在C57BL/6小鼠肺转移模型中薯蓣皂苷抑制B16细胞肺转移实验过程中,各组C57BL/6小鼠的体重无显著差异。肿瘤主动转移模型及被动转移模型结果显示,与模型组相比随着浓度的增加,薯蓣皂苷显著抑制小鼠黑色素瘤B16细胞的肺转移。免疫组化结果显示,与模型组相比,薯蓣皂苷显著上调Cx43,E-cadherin蛋白的表达;显著降低N-cadherin蛋白的表达。四、结论:1、体外实验中,通过上调Cx43可以阻抗黑色素瘤B16细胞的侵袭和转移。薯蓣皂苷上调Cx43的表达及缝隙连接通讯功能且薯蓣皂苷抑制B16细胞的上皮间质转化,薯蓣皂苷通过激活维甲酸受体通路上调Cx43来抑制小鼠黑色素瘤细胞B16细胞的上皮间质转化。2、在肿瘤微环境中,肿瘤相关巨噬细胞占肿瘤微环境的30-50%,薯蓣皂苷通过上调Cx43蛋白的表达提高肿瘤相关巨噬细胞RAW264.7细胞的吞噬能力。薯蓣皂苷促使RAW264.7细胞由M2向M1转化且促进炎性细胞因子的分泌。薯蓣皂苷作用RAW264.7细胞培养液上调Cx43表达,抑制上皮间质转化蛋白表达,抑制肿瘤干细胞标志蛋白的表达。有可能通过上调Cx43蛋白抑制上皮间质转化及肿瘤干细胞数。3、在体内研究中,薯蓣皂苷能显著抑制B16细胞的生长及肺转移,通过上调Cx43抑制上皮间质转化。