肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是一组病因各异且具有共同病理特征的一类肺破坏性疾病,其典型的病理特征表现为肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞过度增生、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积、肺组织结构变形、肺功能衰竭等。国内外医学研究表明,其致病原因复杂多样,例如吸入粉尘、有毒气体、环境污染物,或者继发于呼吸系统疾病、免疫系统疾病等。近年来,由于缺乏有效的治疗策略,PF发病率逐年上升,严重威胁着人类的生命健康。因此,探索高效低毒的治疗药物是当今医药界研究的热点。目前,西医使用药物多为糖皮质激素、免疫抑制剂和细胞毒性药物等,这些药物不良反应多、费用昂贵、并且远期疗效缺乏稳定性;中医药作为我国传统文化的瑰宝,在防治肺纤维化方面取得了较好的进展,文献研究证实,中药复方、单味中药、中药提取物均能较好的改善患者症状并延缓进程。肺痿方是第五批全国名老中医朱启勇教授的临床经验方,具有改善肺纤维化综合症状之功效。该方以“丹参”为君药,“赤芍”、“桃仁”、“水蛭”为臣药,“麦冬”为佐药,“青果”、“木蝴蝶”为使药,以补阴祛瘀为治疗大法,从恢复机体的动态平衡入手,激发人体自身免疫力和康复能力,恢复正常脏腑功能。尽管肺痿方临床疗效确切,但该方药效物质基础不明确,作用机制不清楚。本研究拟采用UPLC-Q-TOF/MS液质联用技术对肺痿方水提物及其入血成分进行分析和鉴定;采用肺纤维化SD大鼠模型对该方抗肺纤维化活性进行了评价;采用代谢组学方法从系统生物学角度阐明其作用机制。具体研究内容包括以下5个部分:1、肺痿方提取工艺研究为了优选肺痿方水提取工艺,本研究采用HPLC法建立该方提取物指纹图谱,对共有峰的峰面积进行主成分分析,以总因子得分作为评价指标,采用L9(34)正交试验设计考察加水量、提取时间、提取次数对其水提取效果的影响,通过极差分析与方差分析相结合,选择肺痿方最优提取工艺。结果指纹图谱共确定了 33个共有峰,其中6个主成分累积方差贡献率达97.72%,最适宜提取工艺为12倍量水提取2次,每次1 h。结果表明应用指纹图谱共有峰作为复方中药提取评价指标,能反映整体提取效果,所确定的工艺稳定可行,为肺痿方的后续开发提供依据。2、肺痿方物质基础研究本实验采用UPLC-Q-TOF/MS液质联用技术,对肺痿方提取物及其入血成分进行了分析和鉴定。液相色谱条件为ACQUITYHSS T3色谱柱(2.1 mm × 100 mm,1.8 μm),以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速0.4 mL/min,柱温40℃;质谱检测条件为电喷雾离子源(ESI),正、负离子模式下扫描采集数据,根据精确质荷比和二级质谱裂解碎片等信息,结合相关文献和对照品信息对化合物进行解析,提取物中共鉴定和推测出109个化合物,主要包括生物碱类、苯丙素类、黄酮及其苷类、糖类、有机酸类、单萜类、二萜类、三蔽类等。其中,24个化合物来源于麦冬,19个化合物来源于桃仁,17个化合物来源于丹参,15个化合物来源于赤芍,14个化合物来源于木蝴蝶,13个化合物来源于藏青果,10个化合物来源于水蛭。在已鉴定完成的体外化学成分基础上,结合相关文献,运用MetaboLynx XSTM数据处理软件,推测出48个入血成分,包括35个原型成分和13个代谢成分。研究结果为进一步控制肺痿方药物质量、研究药效物质基础及作用机制奠定了基础。3、肺痿方质量评价研究本实验采用TLC定性法和HPLC定量法对肺痿方提取物进行了初步质量评价研究。在定性研究中,对处方中七味药材进行了 TLC鉴别,建立了具有良好重现性、专属性的丹参、赤芍、桃仁、麦冬、水蛭等5味药材的定性分析方法;在定量研究中,建立了肺痿方中苦杏仁苷、芍药苷和丹酚酸B的HPLC含量测定方法,方法学研究结果表明,所建立的方法具有较好的线性、精密度、稳定性、重复性和回收率。根据3批样品含量测定结果,暂定为苦杏仁苷含量不得低于0.810 mg/g、芍药苷含量不得低于0.195 mg/g、丹酚酸B含量不得低于0.363 mg/g。3个月加速稳定性结果显示,本品指纹图谱中33个共有峰峰面积RSD均小于5.0%,表明稳定性较好。研究结果表明,肺痿方提取物质量稳定、可控,为进一步进行药效和作用机制研究提供了可靠的保障。4、肺痿方抗肺纤维化作用研究本实验对肺痿方进行了抗肺纤维化活性评价研究,以期进一步验证其药效。取SD大鼠54只,随机分为6组,分别为对照组、模型组、泼尼松组及肺痿方高、中、低剂量组,每组9只。以大鼠气管内滴入博莱霉素方法制造肺纤维化模型,造模8h后,连续灌胃给药28d,分别在造模后第7、14、28天,观察动物的一般状况,测定肺系数,对肺组织进行HE、Masson染色,光镜下观察病理学变化,并测定血清中大鼠转化生长因子βl(TGF-β1)、大鼠白细胞介素-17(IL-17)、大鼠白细胞介素-6(IL-6)含量。结果显示,与模型组比较,肺痿方高、中、低剂量组可改善大鼠精神状态、毛发、饮食等一般状况,降低肺纤维化导致的肺系数升高,缩小纤维化病变范围,减轻病变程度,降低血清中TGF-β1、IL-17、IL-6含量,p值均小于0.05。结果表明,肺痿方具有良好的抗肺纤维化作用。5、肺痿方抗肺纤维化血清代谢组学机制研究本实验在药效学研究的基础上,采用代谢组学方法探究肺痿方抗肺纤维化作用机制。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术与MetaboAnalyst4.0平台,分析药效学实验中各组大鼠血清样品代谢情况,应用多元变量统计分析方法:主成分分析(PCA)与正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),筛选、鉴定肺纤维化相关的生物标志物。通过正常组血清与模型组血清比较,鉴定出17个潜在生物标志物,通过MetPA富集得到了 21条相关的代谢通路,最终筛选出5条主要代谢途径:泛醌和其他萜类醌生物合成代谢通路,磷酸肌醇代谢通路,精氨酸生物合成代谢通路,精氨酸和脯氨酸代谢通路和酪氨酸代谢通路(impact>0.05)。与肺纤维化模型大鼠血清相比,给药组中有11个代谢物上调,有6个代谢物下调,分析结果可知各给药组均能使这17个潜在的内源性生物标志物向对照组回调,即肺痿方可能通过多靶点、多途径发挥抗肺纤维化作用。总之,本研究优化了肺痿方提取工艺,确定了最适宜提取工艺参数;表征了提取物及其在血清中的移行成分,阐明了物质基础;建立了定性定量方法,确保了质量稳定可控;评价了药物活性,证实了抗肺纤维化药效;筛选了生物标志物及主要代谢通路,阐明了代谢组学机制,为将该方开发成物质基础明确,工艺稳定,质量可控,疗效确切,作用机制清楚的现代中药制剂奠定了基础。