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山西省是我国中药材资源大省,但是近年来随着中药材规模化种植,其病毒病危害逐年加重,严重影响着中药材的产量和品质,因此明确其致病病毒病原种类及生物学特征是病毒病防治的基础和关键。由于前人对于中药材病毒病的研究基础薄弱,可供参考的资料相对较少,因此使用传统方法检测中药材病毒非常困难,而小RNA深度测序技术突破了传统病毒检测方法的局限,为植物病毒病检测开辟了新的发展机遇。该技术不依赖于病毒的已知序列信息,且不受病毒含量多少的限制,可以同时检测植物病样中已知和未知的、含量高和含量低的全部病毒,包括DNA病毒、RNA病毒和类病毒,甚至还有极大可能发掘一些新的病毒资源。本研究利用小RNA深度测序技术对山西省中药材主产区的白术、半夏和地黄病毒病病原进行了鉴定,得到实验结果如下:(1)表现典型花叶、黄化和矮化症状的白术被蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV 2)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)及山核桃花叶相关病毒(Pecan mosaic-associated virus,PMaV)所侵染,其中PMaV侵染白术为首次报道。对PMaV白术分离物(PMaV-Am)进行全基因组扩增,得到PMaV-Am基因组全长为9310 nt,具有典型的马铃薯Y病毒属成员的基因组特征,包含一个大的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码一个由2976个氨基酸构成的多聚蛋白。进一步将PMaV-Am与马铃薯Y病毒科(Potyviridae)代表性成员构建氨基酸序列系统进化树,结果显示PMaV-Am与Potyvirus属病毒聚为一个大分支,其中与PMaV-LA分离物单独聚为一簇,亲缘关系最近。(2)表现典型花叶、卷曲症状的半夏被大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)及魔芋花叶病毒(Konjac mosaic virus,KoMV)所侵染。对SMV山西半夏分离物(SMV-SXBX)的全基因组进行克隆,得到SMV-SXBX的基因组全长为9735 nt。进一步对SMV-SXBX与其他不同来源的SMV进行序列相似性分析,结果显示SMV-SXBX与来自半夏的SMV分离物同源性较高,而与来自大豆的SMV分离物相似性较低。氨基酸序列系统进化树分析也显示SMV-SXBX与SMV半夏分离物聚为一簇,而与SMV大豆分离物亲缘关系较远。(3)表现典型花叶、卷曲症状的地黄被地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus,ReMV)和油菜花叶病毒(Youcai mosaic virus,YoMV)所侵染。进一步扩增ReMV和YoMV的CP基因,分别将其与pMal-c2X载体连接,构建原核表达载体pMal-c2X-ReMV CP和pMal-c2X-YoMV CP,将重组载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后得到分子量约60 kDa的重组CP蛋白。该重组蛋白经纯化后可用作病毒抗血清的制备。利用小RNA深度测序结果对检测到的病毒进行了病毒来源小RNA(virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs)长度分布、5’端碱基偏好性、极性分布及小RNA热点区分析,分析结果有助于进一步了解vsiRNAs的产生及在抗病毒防御中的作用,并为病毒和宿主的互作研究及利用宿主RNA沉默设计抗病毒策略提供了理论依据。