【摘 要】
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烟草是以收获叶片为收获物的经济作物,其叶片的大小对产量、质量和品质等方面都有影响,为调控烟草叶片的大小。本研究通过生物信息学预测了NtAN3基因在烟草上的功能,利用基因编辑技术创制了过表达和沉默突变株,分析了NtAN3基因对烟株的叶片大小的影响,同时利用转录组测序分析了NtAN3基因调控烟草叶片大小的机制。得到主要结果为:1、通过生物信息学分析方法对NtAN3基因的功能进行预测,其结果表明;烟草N
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烟草是以收获叶片为收获物的经济作物,其叶片的大小对产量、质量和品质等方面都有影响,为调控烟草叶片的大小。本研究通过生物信息学预测了NtAN3基因在烟草上的功能,利用基因编辑技术创制了过表达和沉默突变株,分析了NtAN3基因对烟株的叶片大小的影响,同时利用转录组测序分析了NtAN3基因调控烟草叶片大小的机制。得到主要结果为:1、通过生物信息学分析方法对NtAN3基因的功能进行预测,其结果表明;烟草NtAN3基因与拟南芥At AN3基因的同源性达到了99%以上,两者的理化性质具有相似性,分子量、亲水性和等电点等相近。功能结构域都含有SSXT结构域,并对烟草NtAN3基因与拟南芥At AN3基因编码的蛋白质二级和三级结构预测,得到两者的蛋白质的二级结构中的β转角和α螺旋等都具有相似性,三级结构也相似,故预测烟草NtAN3基因有着与拟南芥At AN3基因一样的功能,可能有着改变叶片大小的功能。2、利用基因编辑技术构建了NtAN3基因的过表达和沉默载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,经过组织培养得到转化植株。转化植株经过潮霉素Hyg基因和目的基因设计的引物进行检测后分别得到过表达突变植株20株,沉默突变植株4株。并对得到的植株进行基因表达量的测定,结果显示;过表达植株中,目的基因的表达量为1.22,明显高于对照植株的1.04,在沉默植株中,目的基因的表达量为0.75,明显低于对照植株。3、通过对农艺性状的测量和细胞学观察,过表达植株的叶片长度在70.65-76.00cm之间,宽度在35.96-38.14cm之间,明显高于对照植株69.14-71.12cm与33.14-34.89cm之间,沉默突变植株的叶片长度在68.61-71.45cm之间,宽度在32.96-33.47cm之间,明显低于对照植株。对植株叶片的细胞学进行观察发现,过表达植株的细胞数量为28-33个之间,对照的在24-26个之间,明显高于对照,而沉默的细胞数量在19-21个之间,低于对照;过表达植株叶片厚度在270.82-279.19μm之间,而对照的在225.45-229.37μm之间,明显高于对照的叶片厚度。沉默叶片厚度在160.59-170.56μm之间,低于对照;过表达植株细胞的大小也增加,为16.92-18.45μm之间,而对照的为15.13-16.75μm之间,沉默植株细胞大小为13.15-14.81μm之间,明显低于对照。这表明NtAN3基因通过调控叶片细胞数量和细胞大小,进而改变叶片大小。4、突变体转录组测序的结果表明,与对照相比,过表达突变植株G27有差异基因1697个,其中,上调基因数为1035,下调基因数为662。差异基因GO功能主要富集在糖类结合、磷酸盐离子输运、细胞外间隙、几丁质酶活性、几丁质分解代谢过程、氨基聚糖分解代谢过程和氨基糖分解代谢过程等方面。沉默突变植株M21有差异基因2388个,其中的上调基因数为1313,下调基因数为1075。差异基因GO功能主要富集在烯类合成过程、无机离子跨膜转运体活动、韧皮部的发育、几丁质结合、类异戊二烯代谢过程、类异戊二烯生物合成的过程和硫酸盐输送等方面。5、对KEGG途径分析显示,过表达植株主要富集在氮代谢、油菜素内酯的生物合成、氨基糖和核苷酸糖的代谢、酮体的合成与降解、亚油酸的新陈代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、淀粉与蔗糖代谢、α-亚麻酸代谢和甘油脂代谢。沉默植株主要富集在氮代谢、油菜素内酯的生物合成、氨基糖和核苷酸糖的代谢、酮体的合成与降解、亚油酸的新陈代谢、淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、α-亚麻酸代谢和甘油脂代谢。表明NtAN3基因的作用机制是通过改变植物激素信号传导途径中生长素、细胞分裂素和油菜素内酯等过程的相关基因的表达,从而达到改变细胞大小和细胞数量,最终实现改变叶片大小的功能。
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