目的1.研究蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在骨关节炎软骨细胞和软骨组织中的表达情况。2.探讨在体外敲低或过表达SHP2对软骨细胞炎症、代谢、凋亡和迁移的影响,并阐明作用分子机制。3.探讨在小鼠膝关节腔注射腺病毒沉默SHP2对骨关节炎进展的影响。方法1.SHP2表达检测:通过内侧半月板失稳术（DMM）诱导小鼠膝关节OA,用组织免疫荧光技术检测假手术组（SHAM）和DMM组关节软骨中SHP2的表达情况;用免疫印迹（Western blot）检测在IL-1β刺激后的小鼠软骨细胞SHP2、MMP3、MMP13、COL2A1的表达情况。2.软骨细胞代谢检测:q PCR和Western blot检验在小鼠软骨细胞中siRNA敲低或质粒过表达SHP2的效率。q PCR和Western blot检测敲低或过表达SHP2对IL-1β诱导的小鼠软骨细胞相关指标的影响,包括分解代谢指标（MMP3及MMP13）,软骨合成代谢指标（COL2A1,Aggrecan,SOX9）以及软骨肥大指标（COL10A1）。3.软骨细胞凋亡实验:小鼠软骨细胞转染过表达质粒或siRNA后,用凋亡检测试剂盒配合流式细胞计数仪来检测小鼠软骨细胞的凋亡率。4.软骨细胞增殖实验:小鼠软骨细胞转染siRNA或质粒后,用CCK8试剂检测SHP2对细胞增殖的影响。5.软骨细胞迁移实验:小鼠软骨细胞转染siRNA或质粒后,用划痕实验来检测SHP2对细胞迁移能力的影响。6.分子信号通路实验:敲低或过表达SHP2后检测β-catenin表达以及wnt/β-catenin靶基因的表达,并用免疫共沉淀（CO-IP）技术检测SHP2与β-catenin的结合关系;小鼠软骨细胞转染siRNA或过表达质粒后,用IL-1β短时间刺激后抽提蛋白,Western blot检测MAPK、NF-κB信号通路变化。7.体内实验:用DMM诱导OA模型,探讨在体内膝关节腔注射腺病毒沉默SHP2对OA进展的影响;用番红固绿、HE和甲苯胺蓝染色评估软骨损伤严重程度;用免疫组织化学染色评估SHP2在体内对OA关节软骨软骨合成代谢（AGGRECAN、COL2A1）和分解代谢（MMP3和MMP13）的影响。用μCT扫描检测膝关节骨赘生长以及软骨下骨的变化。结果1.SHP2组织免疫荧光染色结果证明,SHP2在DMM组软骨组织中表达明显增多;在体外,随着IL-1β刺激小鼠软骨细胞浓度和时间的增长,SHP2的m RNA与蛋白表达水平逐渐增高,MMP3、MMP13的蛋白表达水平也呈增长趋势,而COL2A1的表达呈下降趋势。2.小鼠原代软骨细胞转染siRNA可以显著抑制SHP2表达,而转染过表达质粒可以显著提高SHP2表达;敲低SHP2抑制IL-1β诱导的分解代谢指标（MMP3及MMP13）和软骨肥大指标（COL10A1）的升高,同时减轻了IL-1β诱导的软骨基质指标（AGGRECAN和COL2A1）的降解。相反,过表达SHP2可以提高IL-1β诱导的分解代谢指标（MMP3及MMP13）和软骨肥大指标（COL10A1）的升高,但是加重了IL-1β诱导的软骨基质指标（AGGRECAN和COL2A1）的降解。3.Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞仪结果说明IL-1β可以诱导小鼠软骨细胞凋亡,而抑制或过表达SHP2均不影响凋亡。4.CCK8检测证明SHP2对小鼠软骨细胞的增殖无明显作用。5.划痕实验显示SHP2不影响小鼠软骨细胞的迁移。6.Western blot结果表明敲低SHP2会抑制β-catenin和wnt/β-catenin靶基因AXIN2、LEF1和TCF4的表达,过表达的结果则相反。CO-IP结果证明SHP2与β-catenin可以结合形成复合体。7.Western blot结果显示IL-1β在15-30分钟激活了MAPK和NF-κB通路,而抑制SHP2可以抑制IL-1β诱导的MAPK和NF-κB的激活,过表达则会促进IL-1β诱导的MAPK和NF-κB通路激活。8.HE、甲苯胺蓝、番红固绿等染色结果,OARSI评分,以及μCT扫描结果表明,关节腔注射腺病毒沉默SHP2可以抑制DMM手术诱导的软骨破坏和骨赘生成,而不影响软骨下骨。软骨组织AGGRECAN、COL2A1、MMP3和MMP13的免疫染色表明,沉默SHP2的表达可以显著抑制OA软骨细胞的分解代谢,而促进合成代谢,延缓软骨基质降解破坏。结论1.SHP2在小鼠OA软骨组织和软骨细胞中表达显著增高。2.在体外,SHP2可以促进软骨细胞的分解代谢,抑制合成代谢,而不影响软骨细胞的增殖、凋亡、迁移;β-catenin、MAPK和NF-κB等信号通路均参与了SHP2在OA中的破坏过程。3.在体内,膝关节腔注射腺病毒敲除SHP2可以抑制OA软骨细胞炎症分解代谢、促进合成代谢,从而抑制软骨破坏和软骨基质降解,延缓OA进展。这说明SHP2可以作为OA的候选治疗靶标。