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目的:探索Gremlin-1作为一种内源性骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)信号通路的抑制因子,对发生重复损伤的视网膜色素上皮细胞(Retinal pigmented epithelium,RPE)逐渐出现再分化障碍以及上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用。方法:为了建立RPE细胞的重复损伤模型,反复传代培养的人胎儿视网膜色素上皮细胞(fetal RPE,fRPE)被认为是一种重复损伤模型。为了探究Gremlin-1的作用,我们利用重组人类Gremlin-1(0.1μg/ml·d)处理细胞,并且利用si RNA敲除GREM1来探索该基因表达下降后是否能够抑制EMT的发生。为判断细胞的形态学变化,我们利用相差显微镜观察细胞的形态,并且在亮视野下可以观察色素的形成,色素的出现意味着RPE细胞更趋向于正常的形态,并且在此基础上我们利用了细胞划痕实验来判断Gremlin-1对于细胞迁移率的影响。为了判断细胞是否有RPE细胞特定的功能,我们利用q-PCR来检测不同实验组的RPE细胞的基因表达:Gremlin-1的编码基因—GREM1;正常RPE功能基因,包括TJP1,PMEL,BEST1,RPE65,MERTK;RPE细胞胚胎分化的基因,包括OTX2和MITF;EMT的特征性基因,包括SNAI1,VIM。除此以外,为了在蛋白质表达水平上验证实验结果,我们还利用western blot来检验一些特征性的蛋白,包括P-cadherin,ZO-1,Vimentin,Smad4以及一些磷酸化的Smads。最后,为了验证干扰BMP信号通路是否会干扰RPE细胞的再分化以及促进上皮间充质转化,我们在未经过处理以及加入TGF-β抑制剂的低代次fRPE细胞中加用LDN193189彻底阻断BMP信号通路,这是一种人工合成的广谱BMP信号通路化学小分子。结果:在fRPE细胞中,随着细胞传代次数的增加,GREM1的表达量逐渐增加,于此同时,其功能基因(TJP1,PMEL,BEST1,RPE65,MERTK)的表达量逐渐下调,而EMT相关基因(SNAI1,VIM)却逐渐上调,与此同时,western blot的结果表明,RPE的特征性蛋白P-cadherin下调。除此之外,我们发现在P2与P4的细胞中,GREM1与SNAI1有着大致相同的表达趋势,即正在发生EMT的细胞中,GREM1以及SNAI1保持逐渐上调的趋势,而未发生EMT的细胞中,二者持续处于低表达的过程。在P2细胞中加用重组人类Gremlin-1蛋白后,P2的fRPE细胞逐渐向EMT特征的形态变化,MITF、OTX2以及RPE65出现下调,SNAI1以及VIM上调,蛋白水平上,ZO-1表达减少,Vimentin表达增加,同时活化的TGF-β信号通路下游的转录因子,即磷酸化的Smad2表达增加。相反在P4代敲除GREM1后,MITF,OTX2以及RPE65的表达上调,VIM表达下调,ZO-1表达增加,Vimentin表达减少,但是SNAI1以及磷酸化的Smad2未有改变。最后,加入LDN193189彻底阻断BMP信号通路后,即使加入TGF-β抑制剂,P2的细胞依然会出现EMT以及再分化障碍,并且GREM1会相应的表达增加。结论:在fRPE细胞中,Gremlin-1通过促进TGF-β信号通路并且抑制BMP信号通路诱导EMT的发生,同时阻止细胞的再体外培养的再分化。相反,当我们利用si RNA敲除其标记基因GREM1后,BMP信号通路的抑制程度得到了减轻,整体上在一定程度削弱了EMT的发生,同时促进了细胞的再分化,然而GREM1的敲除并没有对TGF-β产生影响。因此,鉴于Gremlin-1在EMT发生中的促进作用,其可能在增殖性玻璃体视网膜疾病(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)以及视网膜下纤维化(Subretinal fibrosis)的过程中起到了重要作用,而后者是影响抗VEGF药物治疗湿性年龄相关性黄斑变性疗效的重要因素之一,使其成为潜在的治疗靶点以及生物标志。