论文部分内容阅读
大肠杆菌O157:H7是大肠杆菌中的一种具有高致病性的食源性致病血清型,有报道称低于10个菌就能够致病,如何快速灵敏地检测大肠杆菌O157:H7引起了广泛关注。因此,本文分别建立了传统ELISA方法、基于生物素–链霉亲和素信号放大的ELISA方法、集成杂交链式反应和生物素–链霉亲和素信号放大的ELISA方法,旨在找到一种准确快速的ELISA方法高灵敏检测大肠杆菌O157:H7。本文首先采用传统的双抗夹心ELISA方法检测大肠杆菌O157:H7。通过优化抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的浓度,传统的ELISA方法在培养基和牛奶样品当中的灵敏度分别为4.88×104 CFU/mL和5.08×104 CFU/mL,变异系数分别为1.31%–6.87%和1.52%–7.81%。采用生物素–链霉亲和素信号放大ELISA方法检测大肠杆菌O157:H7,通过优化生物素化抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体浓度,在培养基和牛奶样品中灵敏度分别为2×104 CFU/mL和3.23×104 CFU/m L,变异系数分别为1.12%–8.63%和1.25%–9.61%。两种传统ELISA方法特异性良好,变异系数低,稳定性好,均能实现对牛奶样品的加标检测,但两种方法的灵敏度都较低。本文最后构建了基于HCR及生物素–链霉亲和素信号放大系统的双抗夹心ELISA方法,实现了对大肠杆菌O157:H7的快速灵敏检测。将大肠杆菌O157:H7的多抗包被在酶标板之后,加入标记了大肠杆菌O157:H7单抗和DNA1引发序列的胶体金复合物。当存在目标菌株时,将会形成多抗–目标菌–单抗–胶体金–DNA1复合物。复合物与加入的生物素化H1和生物素化H2发生杂交链式反应,形成一个带缺口的包含大量生物素的双链结构DNA,生物素将与链霉亲和素化的酶发生酶催化底物显色反应。通过优化胶体金探针单抗、多抗、生物素化H1及H2加入浓度,DNA1标记量,封闭剂的选择,HCR反应时间,酶反应动力学时间及温度,得到的最优条件为:单抗标记量150μg/m L;多抗包被浓度10μg/mL;生物素化H1及H2加入浓度0.25 nmol/mL;DNA1标记量400μL(1 nmol/mL);封闭剂选择为3%BSA;HCR反应时间为75 min;酶反应动力学时间和温度分别为10 min和37°C。在最优条件下,大肠杆菌O157:H7的检测线性范围为5×102–1×107 CFU/mL,在培养基和牛奶样品中灵敏度分别为1.08×102 CFU/mL和2.60×102 CFU/mL。特异性实验表明该方法特异性良好,并且在培养基和牛奶样品当中的变异系数分别为0.99%–5.88%和0.76%–5.38%。本文建立的基于HCR及生物素–链霉亲和素信号放大ELISA方法与传统双抗夹心ELISA和生物素–链霉亲和素信号放大ELISA相比,灵敏度分别提高了451倍和185倍。综上所述,本文所建立的新型ELISA方法特异性强,灵敏度高,稳定性好,可以实现对大肠杆菌O157:H7的快速灵敏检测。