猪δ冠状病毒（Porcineδcoronavirus,PDCo V）是一种单股正链RNA病毒,属于套式病毒目、冠状病毒科,该病毒感染仔猪主要引起腹泻和死亡。PDCo V于2014年在美国爆发流行,很快传播至多个州。随后,在多个国家发现PDCo V的存在,给养猪业造成了一定的经济损失,引起养猪业的高度重视。此外,有研究报道称PDCo V可以感染犊牛和鸡,最近研究报道可以感染人,说明该病毒具有跨物种传播的能力。目前,PDCo V是唯一一个通过体外细胞培养成功分离的δ冠状病毒属成员,因此,PDCo V是研究δ冠状病毒属的良好模型。内质网（Endoplasmic reticulum,ER）是细胞内蛋白合成、加工、成熟和运输的主要场所。病毒感染可通过宿主的内质网膜系统进行蛋白复制,在内质网中聚集大量的错误折叠蛋白或未折叠蛋白,继而引起内质网应激。细胞为了维持内环境稳态,已经演化产生了一种非常保守的适应性反应,称为未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）。早期研究表明,许多病毒可通过精细地调控UPR,使其达到最佳的复制与致病目的。作为一种新型猪肠道冠状病毒,PDCo V与UPR之间的关系尚不清楚。因此,本研究以PDCo V CHN-HN-2014毒株为代表,探讨PDCo V感染与UPR之间的关系。具体研究内容如下:1.PDCo V感染激活IRE1/XBP1途径将PDCo V接种于猪肾小管上皮细胞（LLC-PK1）、猪小肠粘膜上皮细胞（IPI-2I）,通过RT-PCR实验检测PDCo V感染后不同时间点XBP1的剪切情况。结果发现,病毒感染后切割产生的XBP1（s）随时间延长而增加。荧光定量实验结果显示XBP1（s）的m RNA水平逐渐升高。以上结果表明PDCo V感染可以激活IRE1/XBP1途径。另外,荧光定量实验检测下游效应分子EDEM1和ERDJ4的m RNA水平,发现PDCo V感染对EDEM1和ERDJ4的表达无明显影响,这表明宿主采用某种机制拮抗了这些效应分子的表达。2.PDCo V感染激活PERK途径将PDCo V接种于LLC-PK1和IPI-2I细胞,Western blot实验检测PDCo V感染后不同时间点磷酸化的e IF2α蛋白水平。结果发现,病毒感染后磷酸化的e IF2α蛋白表达量随时间延长而增加。同时,荧光定量实验结果表明,ATF4、GADD34和CHOP的m RNA表达水平随时间延长显著上调。利用嘌呤霉素标记新生蛋白的方法,Western blot实验检测发现PDCo V感染显著抑制宿主蛋白翻译,呈剂量依赖性。这些结果表明PDCo V感染激活PERK途径,并且抑制宿主蛋白翻译。3.PDCo V感染未激活ATF6途径将PDCo V接种于LLC-PK1和IPI-2I细胞,荧光定量实验检测PDCo V感染后不同时间点ATF6途径相关效应分子GRP78、GRP94、Calnexin、Calreticulin和ERp57的m RNA水平,结果发现PDCo V感染对ATF6途径的相关效应分子无明显影响。Western blot实验结果表明,PDCo V感染对ATF6途径相关效应分子GRP78、GRP94、Calreticulin、PDI以及转录因子p50ATF6的蛋白水平也无明显影响,这些结果表明PDCo V感染不激活ATF6途径。4.IRE1和PERK途径对病毒复制的影响为进一步确定IRE1、PERK途径是否影响PDCo V的复制,通过药物处理、过表达实验和RNA干扰实验,发现干扰IRE1途径没有影响病毒的增殖,而干扰PERK途径明显抑制PDCo V的增殖。为进一步探讨PERK途径在PDCo V增殖中发挥的作用,在LLC-PK1细胞上过表达e IF2α,结果显示e IF2α表达促进病毒m RNA水平上调,这些结果表明PERK途径有利于病毒复制。5.PDCo V NS6蛋白激活UPR 3条途径此外,为进一步确定PDCo V编码的哪些蛋白参与UPR的调控,通过UPRE和ERSE双荧光素酶报告系统对PDCo V编码的所有蛋白进行筛选。结果发现,在所有蛋白中NS6蛋白上调UPRE和ERSE启动子活性的能力最强,后续对其调控UPR进一步分析。结果发现在HEK-293T细胞上过表达NS6可以激活UPR的3条途径。