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研究背景:心肌纤维化是一种广泛存在于心血管疾病,如高血压、糖尿病心肌病、急性心肌梗死的病理过程,主要表现为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白的分泌紊乱、胶原代谢及合成失调,其中心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)的增殖及转分化是重要的病理基础。CFs在受到刺激后,转化为以分泌a-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,a-SMA)为主的肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB),MFB是引起胶原合成失衡,ECM过度沉积的效应细胞。因此,抑制其增殖及转分化十分关键。Sirtuins是一类依赖于NAD+的去乙酰化酶包括SIRT1-7。其中,SIRT3主要定位于线粒体,在调节细胞的能量代谢、氧化应激等方面发挥巨大作用。SIRT3可以减轻氧化应激损伤,同时,也能去乙酰化多种代谢酶和转录因子。研究表明,SIRT3敲除小鼠在8周龄时可自发形成纤维化;此外,有报道称白藜芦醇能够激活SIRT3,进而抑制TGF-β/SMAD通路,改善小鼠心肌纤维化。以上研究提示SIRT3具有抗纤维化作用,但SIRT3在抑制ANG Ⅱ诱导的CFs转分化中的具体作用机制有待进一步研究。过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(peroxisome proliferator activated receptor,PPARγ)是核受体转录因子超家族成员之一,能够调控胰岛素敏感性、成脂细胞的分化等,同时也能改善心肌纤维化,抑制TGFβ诱导的CFs转分化。此外,PPARy可以受到乙酰化调节,有研究报道,SIRT1和罗格列酮皆可以使PPARy的去乙酰化水平增高,促进其活性。β-链蛋白(β-catenin)是Wnt信号通路中的关键因子,能促进心肌成纤维细胞的转分化,引起心肌纤维化。既往研究表明,SIRT3的激活能去乙酰化和激活GSK-3β,进而抑制其下游的β-catenin的磷酸化,促进其降解,改善年龄相关性组织的纤维化。此外,越来越多的研究发现PPARγ和β-catenin之间能相互调控。上述研究提示SIRT3在抑制心肌成纤维细胞转分化方面有重要作用,其作用机制可能是通过调控β-catenin/PPARy信号通路。本实验拟以血管紧张素Ⅱ刺激新生SD大鼠原代心肌成纤维细胞,诱导细胞的增殖及分化,探讨SIRT3在ANGⅡ诱导的CFs转分化的作用,以及β-catenin/PPARy信号通路在SIRT3抑制CFs转分化中的作用。研究目的:1.探讨SIRT3在ANGII诱导的CFs转分化的作用。2.探讨PPARy对CFs增殖及转分化中的作用。3.探讨SIRT3抑制CFs转分化的作用机制及可能通路。研究方法:1.大鼠原代心肌成纤维细胞的分离、培养提取新生SD大鼠心脏中的心肌成纤维细胞。采用含有10%胎牛血清和双联抗生素的高糖DMED培养基培养细胞,并将细胞置于37℃,含5%CO2的细胞培养箱中培养。2.细胞干预采用ANG Ⅱ(100nmol/L 48h)刺激诱导CFs的转分化,小干扰RNA和病毒转染沉默或者过表达SIRT3,采用吡格列酮(Pioglitazone,PIO)及GW9662激活或抑制PPARγ的表达,XAV939抑制β-catenin的表达。3.蛋白质免疫印迹提取CFs的总蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,采用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭2h后,用特异性一抗4℃摇床孵育过夜。二抗室温孵育1小时后采用ECL发光液显影目的条带,AI600发光仪检测。4.实时定量PCR采用Trizol法提取CFs中的RNA,检测其浓度与纯度,并逆转录为cDNA,采用SYBR green法检测目的基因的表达量。5.细胞免疫荧光将细胞置于免疫固定液中固定30min,加入0.5%Triton打孔25min,采用1%BSA封闭30min,加入特异性一抗,4℃孵育过夜。避光,加入相应的FICT/FIRCT标记的免疫荧光二抗,37℃孵育1h;DAPI染核5min,抗荧光淬灭剂封片,采用荧光显微镜检测。6.CCK-8 检测采用CCK-8试剂盒检测CFs的增殖。7.统计学分析采用GraphPadPrime6软件分析数据,每组实验重复3次,所有数据均采用x±s表示。两组之间比较采用成组t检验分析,多组之间的差异采用单因素方差分析法(oneway-ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.SIRT3能抑制ANG Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞转分化ANG Ⅱ处理48h后,SIRT3过表达+ANG Ⅱ组与ANG Ⅱ组相比,a-SMA的蛋白表达减少;SIRT3小干扰+ANG Ⅱ组与Control组相比,a-SMA的蛋白表达增多。细胞免疫荧光也显示小干扰SIRT3后a-SMA荧光强度增加。提示SIRT3能抑制ANG Ⅱ诱导的CFs转分化。2.PPARγ的激活可抑制ANG Ⅱ诱导心肌成纤维细胞的增殖及分化SIRT3过表达组与Control组相比,PPARy的蛋白和mRNA表达增多,乙酰化的PPARγ表达减少。为进一步验证PPARy的作用,采用PIO激活PPARy,将细胞分为 Control 组、ANG Ⅱ 组、PIO+ANG Ⅱ 组。与 ANG Ⅱ 组相比,PIO+ANGⅡ组a-SMA的蛋白和mRNA表达减少,荧光强度减弱,CCK-8显示细胞增殖减少。提示PPARγ的激活能够减缓CFs转分化,而且PPARγ的激活可能与SIRT3有关。3.PPARγ的抑制能抑制SIRT3的抗纤维化作用为进一步验证SIRT3对PPARy的调控作用,我们采用GW9662抑制PPARy的表达。将细胞分为Control组、ANGⅡ组、SIRT3过表达+ANGⅡ组、SIRT3过表达+GW9662+ANG Ⅱ组。结果显示:加入GW9662后,与SIRT3过表达+ANGⅡ组相比,a-SMA的蛋白和mRNA表达增多,细胞免疫荧光强度增强。提示SIRT3的抗纤维化作用部分依赖于PPARy的激活4.SIRT3抑制心肌成纤维细胞的转分化依赖于β-catenin/PPARγ通路SIRT3主要定位于线粒体,PPARγ是核内转录因子,所以我们进一步探讨SIRT3对PPARy的调控机制。既往报道及我们的研究发现,SIRT3过表达时,β-catenin的表达减少,SIRT3抑制时则表达增多;同时,PPARγ激活时β-catenin表达减少,PPARy抑制时则表达增多。为验证β-catenin在SIRT3调控PPARy中的作用,我们采用XAV939抑制β-catenin的表达,结果显示,抑制β-catenin表达能促进细胞内PPARγ的表达。因此,结果提示SIRT3抑制CFs的转分化部分依赖于β-catenin/PPARγ通路。结论:1.SIRT3能抑制ANGⅡ诱导的心肌成纤维细胞转分化。2.PPARy能抑制ANG Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞转分化。3.SIRT3可通过β-catenin/PPARγ通路抑制心肌成纤维细胞的转分化。