化痰祛湿和益气健运方药通过自噬改善巨噬细胞炎症反应的机制研究

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目的:近年来,肥胖成为了一个全球性的公共卫生问题,被世界卫生组织认定为影响人类健康的第五大危险因素。肥胖不仅可引起生理层面的不良健康结局,还会对心理健康产生严重的不良影响,日益令人担忧,采取有效的手段干预肥胖显得尤为重要。中医认为气虚和痰湿体质是肥胖常见的体质类型,导师王琦教授自拟“化痰祛湿方”(即“薏脂颗粒”)和“益气健运方”(即“茯元颗粒”)临床灵活配伍、通过调体减肥获得显著疗效,但从未对两方的作用进行细胞层面的探索。本课题旨在通过体外细胞实验观察两方对RAW264.7巨噬细胞炎症模型细胞活力、炎症因子、细胞自噬的影响,并探索两方发挥作用的可能机制。方法:建立棕榈酸(100 μmol/L)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型模拟肥胖,用不同浓度的化痰祛湿药液与益气健运药液干预细胞,通过CCK-8法进行细胞活力测定,通过Elisa方法检测细胞培养基中的炎症因子(MIF,TNF-α,MCP-1,IL-6,IL-10,YM-1,Arg-1,TGF-β1),通过 Western Blot 方法检测细胞自噬蛋白和炎症关键指标(CD36,Beclin1,LC3,TFEB),通过自噬抗体芯片检测自噬相关的20个重要蛋白。(分组:DMEM组、DMSO组、PA组(即棕榈酸组)、TS-50组、TS-100组、TS-150组(TS组为化痰祛湿药液组)、QX-50组、QX-100组、QX-150组(QX组为益气健运药液组)、HF组(即合方组)、TT组(即阿托伐他汀钙组)、YX组(即甘露颗粒药液组))结果:①24小时后的细胞活力除QX-10组对细胞略有影响外,其余组别的影响均无统计学意义。而48小时后,细胞活力被药液影响的情况才显现出来,化痰祛湿药液的TS-75、TS-100、TS-200组与益气健运药液所有浓度组均对RAW264.7细胞的炎症模型活力产生显著影响(P<0.01)。②总体而言,PA组的细胞培养基中促炎因子较高而抗炎因子较低(P<0.05),两个中药方干预后促炎因子(MIF,TNF-α,MCP-1,IL-6)较低而抗炎因子(IL-10,YM-1,Arg-1,TGF-β 1)较高(P<0.05)。③与 PA组相比,TS-100组的细胞CD36较高,QX三个浓度组的细胞CD36均较低(P<0.05)。QX-50组、QX-100组的细胞Beclin 1较高(P<0.05或P<0.01)。除QX-100组外,TT组较其他组的细胞核内TFEB表达降低(P<0.05或P<0.01)。除TT组外的其他四个试验组比较虽无统计学差异,但从数值上看,PA组较低而TS-100组较高。④与DMEM组相比,两种药液6个浓度组的细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ均较高(P<0.05或P<0.01),TT组的细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ较药液组都低(P<0.01)。加入Baf A1后,PA组细胞LC3-Ⅱ虽较DMEM组有堆积但无统计学差异,TS-100组、QX-100组、HF组、TT组的LC3-Ⅱ表达量均较DMEM组升高(P<0.05或P<0.01)。⑤使用自噬抗体芯片检测后,PA组与DMEM组差异表达蛋白共15个,均为上调差异。PA组与TS-100组差异表达蛋白共17个,16个为下调差异,ATG10为上调差异。PA组与QX-100组差异表达蛋白共16个,14个为下调差异,ATG10与ATG12为上调差异。结论:①根据细胞活力测定的结果,同时考虑到两种药液干预细胞的浓度一致性及后续实验,由此确定两药液干预细胞的浓度梯度分别为50mg/L、100mg/L与150mg/L。②棕榈酸诱导的RAW264.7巨噬细胞以具有促炎作用的M1型为主,造模成功。化痰祛湿方和益气健运方以及合方对炎症因子的影响趋势总体上与PA组相反,说明两方具有一定的抗炎效果。阿托伐他汀钙作为阳性对照药,对炎症因子的影响趋势总体上也都与PA组相反。③化痰祛湿方或可通过提高细胞CD36蛋白的表达量,促进抗炎因子产生,使CD36发挥其作为清道夫受体的抗炎作用,从而维持巨噬细胞的稳态。而益气健运方可能影响了 CD36作为外源长链脂肪酸受体的这一功能表达,减轻了棕榈酸引发的炎症对于细胞的损伤。棕榈酸可能有抑制自噬的作用,两方都可促进自噬,合用效果更佳。阿托伐他汀钙也可促进自噬,但其自噬的速率可能高于两方。④化痰祛湿方对于自噬降解阶段发挥的作用可能更大,从而拮抗了 SNCA对自噬溶酶体降解的抑制作用,而益气健运方对于自噬起始阶段发挥的作用可能更大。两方可能通过促进自噬改善了细胞炎症状态,从而达到减肥的目的。
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