目的:心力衰竭(Heart failure,HF),简称心衰,是多种心血管疾病的终末阶段,本研究旨在从调控心脏-脾脏单核/巨噬细胞的表型与动员机制为关键切入点,利用左冠状动脉前降支(Left anterior descending coronary artery,LAD)结扎术制备心衰动物模型,从功能与结构两个方面探讨脾脏及其释放的炎性细胞与心功能的关系,以及益气活血解毒方芪参颗粒通过脾脏AT1-心脏单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)/CC趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2,CCR2)信号通路调控“心-脾轴”单核/巨噬细胞表型与功能进而防治心衰的机制研究。方法:1.为探讨脾脏动员机制在心衰疾病中的作用机制,采用LAD结扎术制备心肌梗死后心衰的动物模型,随机将大鼠分为模型组、脾切组及阳性药福辛普利组,另设立假手术组作为对照。其中脾切组在LAD结扎术前行全脾切除术(Splenectomy)。利用心脏超声评价心功能;利用Haematoxylin-eosin(HE)染色检测心肌组织中炎性细胞浸润与脾脏基本结构的变化情况;利用免疫荧光染色检测心肌组织中相关细胞表型的变化。2.为阐明心衰有效方剂—苗参颗粒“从脾论治”防治心衰的作用机制,采用上述方法制备模型后,给予芪参颗粒灌胃给药21 d,心脏超声评价心脏收缩舒张功能;HE染色检测脾脏基本形态及组织中单核细胞的变化;放射免疫法检测循环中Ang II的含量;利用蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测脾脏组织中与动员机制相关ATI、MCP-1蛋白的表达水平。3.为进一步揭示芪参颗粒调控心肌巨噬细胞M1/M2平衡进而改善心功能的作用机制,利用免疫荧光染色检测心肌组织中M1、M2型巨噬细胞不同表型的数量变化;结合马松、天狼星红染色检测心肌组织中胶原纤维化情况;利用CD31免疫组化染色检测血管新生情况;利用WB检测心肌细胞中MCP-1、CCR2、AT1、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad3纤维化相关蛋白及血管新生相关蛋白的表达;从M1、M2不同表型巨噬细胞介导的抗纤维化与促血管新生机制阐释芪参颗粒改善心功能的具体机制。4.阐明芪参颗粒调控心衰小鼠“心-脾轴”单核/巨噬细胞表型进而防治心衰的作用机制,鉴于小鼠的流式细胞抗体更为全面,因此采用LAD结扎术制备小鼠心衰模型进行研究,随机将小鼠分为模型组、脾切组、芪参颗粒组和福辛普利组,设假手术组作为对照。分别于术后24h,7d及14d三个时间点取材,采用心脏超声评价各组小鼠不同时期的心功能;利用血生化检测各组小鼠血清中不同时期的肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脱氢酶同工酶(Lactate dehydrogenase1,LDH1)的含量,综合以上结果评价芪参颗粒在心衰不同时期的药效作用。针对芪参颗粒对心衰修复期(给药7 d)心功能的调控最为显著,因此,以此时间点切入进一步探讨心衰后脾脏-心脏免疫细胞的迁移和分化的情况。结合HE染色检测小鼠脾脏结构与炎性细胞的变化;采用流式细胞术检测脾脏、循环中单核细胞以及心肌组织中巨噬细胞的表型与数量的变化;此外,ELISA检测小鼠Ang Ⅱ的表达。综合以上结果阐释心衰后芪参颗粒对“心-脾轴”单核/巨噬细胞表型变化的影响。结果:1.超声结果显示,LAD结扎21 d后,模型组大鼠心肌的射血分数(Ejectionfraction,EF)和短轴缩短率(Fractional shortening,FS)显著下降。脾切组EF与FS值明显升高;阳性药组EF值亦见回升。脾脏HE结果显示,模型组脾脏白髓区边界不清,边缘区消失且炎性细胞大量减少;给予阳性药后,脾脏基本结构逐渐恢复,炎性细胞丢失减少。心肌组织HE显示,与假手术组相比,模型组梗死边缘区大量炎性细胞浸润;较之模型组,脾切组炎性细胞浸润减少,阳性药组炎性细胞浸润也相对减少。心脏免疫荧光结果显示,与假手术组相比,模型组M1型巨噬细胞数量明显上升,但M2型巨噬细胞数量无明显变化;脾切组M1型巨噬细胞数量显著下降,M2型巨噬细胞未见明显变化;阳性药组M1型巨噬细胞数量明显降低,M2型巨噬细胞相对增加。2.给予芪参颗粒干预后,心衰大鼠EF值显著上升。脾脏HE结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠脾脏的白髓边缘区模糊不清,红髓区细胞数量减少;与模型组相比,芪参颗粒组可以显著提高脾脏红髓中细胞数量。其次,与假手术组比,模型组Ang Ⅱ水平明显上升;较之模型组,芪参颗粒组循环中Ang Ⅱ水平明显下降。WB结果显示芪参颗粒组能显著下调AT1、MCP-1蛋白水平的表达。3.心肌组织免疫荧光结果显示,与假手术组比,模型组M1型巨噬细胞数量显著上升,M2型巨噬细胞数目较少;较之模型组,芪参颗粒组可以降低M1型巨噬细胞数量,同时显著上调M2型巨噬细胞数量。马松染色和天狼星红染色结果显示,与假手术组比,模型组胶原纤维组织浸润明显,较之模型组,芪参颗粒组能有效抑制心肌间质胶原的过度沉积。CD31免疫组化结果显示,芪参颗粒组可以促进梗死边缘区毛细血管数量。WB结果显示,芪参颗粒组能够显著下调心肌组织中与巨噬细胞募集相关的MCP-1、CCR2、AT1、TGF-β1/Smad3纤维化相关蛋白的表达并上调血管新生相关蛋白的表达。4.超声结果显示,24 h模型组EF和FS值显著下降,芪参颗粒组EF和FS值得到改善,但未见统计学意义;7d和14 d芪参颗粒组小鼠的EF和FS值均得到明显回升,且延长给药时间至14 d,芪参颗粒组EF和FS值较给药7 d芪参颗粒组未见明显变化。心肌酶谱检测结果显示,术后24 h模型组CK-MB和LDH1显著升高,7 d和14 d模型组CK-MB和LDH1变化不明显。芪参颗粒组干预24 h,可显著抑制CK-MB、LDH1的释放,发挥保护心肌损伤的作用。综上,芪参颗粒给药7 d,能够显著改善心衰小鼠的心肌收缩功能。因此,以给药7d为时间点,探讨芪参颗粒调控“心-脾轴”免疫细胞分型的相关研究。7 d模型组小鼠脾脏整体结构显示,心衰能够造成脾脏的长度增大;给予中药干预后,脾脏长度趋于正常。脾脏HE结果显示,心衰小鼠脾脏白髓边缘区消失,红髓区细胞数减少;芪参颗粒组红髓区细胞数量显著上升。脾脏流式细胞术显示,模型组CD11b+数量显著降低,以Ly6Chigh单核细胞数目居多;芪参颗粒组CD11b+细胞数量明显升高,且可明显抑制Ly6Chigh单核细胞表达。血液流式细胞术显示,模型组中CD11b+细胞数量显著上升,而芪参颗粒组可以显著降低CD11b+细胞的数量。针对脾脏动员的启动因素,对血浆中Ang Ⅱ浓度进行研究,结果显示,模型组Ang Ⅱ水平明显上升,芪参颗粒组能够显著降低循环中上升的Ang Ⅱ水平。心脏流式细胞术显示,心衰小鼠心肌组织中F4/80+CD11b+数量显著上升,而芪参颗粒组可以明显降低F4/80+CD11b+细胞的数量。结论:心肌缺血后,脾脏通过释放炎性细胞并被受损心肌招募进而参与心功能的形成,其机制可能与RAAS激活相关。芪参颗粒能够显著上调心肌缺血引发的大鼠心功能的下降,其机制与该药能够通过抑制脾脏AT1受体的激活进而抑制炎性细胞释放有关。而在心肌组织中,芪参颗粒一方面抑制受损心肌MCP-1/CCR2通路招募循环中单核细胞;另一方面,芪参颗粒具有调控巨噬细胞表型的功能。该药主要通过抑制M1型巨噬细胞激活的TGF-β1/Smad3途径实现抗心肌纤维化作用;同时,也可促进M2型巨噬细胞的分化进而产生血管内皮生长因子来发挥促血管生成作用。而芪参颗粒可以抑制脾脏释放的以促炎型Ly6Chigh为主的单核细胞,抑制心肌组织中促炎型M1型巨噬细胞的募集。本研究通过明确心-脾之间的联系以及芪参颗粒干预不同时期心衰模型的机制研究,不仅揭示了脾脏介导炎性细胞的释放参与心衰心功能的形成,还为中药复方芪参颗粒调节以单核/巨噬细胞的表型与迁移为核心的免疫网络进而防治心衰提供了科学依据,同时也为心衰药物治疗与药物研发提供新的靶标与途径。