脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一种严重威胁人类生命和健康的常见疾病。近年来随着现代工矿、交通、建筑业的高速发展,外伤导致SCI患者数量日渐增多,且多发生于青壮年人群中。大部分患者因SCI而导致终生残疾,给社会和家庭带来沉重的负担。目前人类还没有找到对SCI治疗的特效方法。现阶段仍以稳定创伤致不稳定的脊柱、解除脊髓压迫为基础的手术治疗；加之早期使用一些药物对症治疗及后期的康复训练。但遗憾的是治疗效果一直没有明显的提高。近年来,组织工程的飞速发展及对SCI后的病理改变、机理认识不断深入,骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)移植修复重建SCI,取得一定的疗效。BMSCs是骨髓造血系统中的非造血干细胞,具有多项分化潜能,加之又取材方便、扩增迅速、可自体移植、免疫原性低等特点,成为组织工程研究领域理想的种子细胞之一。实验证明具有很强的增殖能力和多向分化潜能,可分化为骨、软骨和韧带、脂肪等多种组织细胞,也有向神经元样细胞、神经干细胞的分化能力；同时植入体内的BMSCs能够产生多种神经营养因子,均有助于SCI的恢复。但是实验发现分化了的神经元样细胞及分泌的营养因子随时间的增加会逐渐减少。受以上因素的启发,为探讨移植的最佳次数,为将来使用自体移植BMSCs于临床治疗SCI,提供依据。目的：1.建立SCI模型,通过蛛网膜下腔置管移植Hoechst33342标记了的BMSCs。2.观察多次移植BMSCs在成年大鼠脊髓损伤区内的迁移、存活、转归。3.观察分化的神经元样细胞的存活；表达的巢蛋白(Nestine)及神经丝蛋白(NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的阳性表达的变化；BBB评分的变化。4.探讨对神经功能修复的可能机理及最佳的移植次数。方法：1.我们采用密度梯度分离与细胞贴壁培养相结合的方法获得同种异体第二代(P2) BMSCs, Hoechst33342标记后,经损伤平面蛛网膜下腔中段放置一硅胶管注入标记的BMSCs。2.采用改良的Aell’s法90只Wistar大鼠进行造模,在T9-10阶段,采用打击势能10g×9cm,打击一次,在距离2cm处进行蛛网膜下腔埋管。SCI术后BBB评分,小于4分为纳入标准。随即分5组。A组经蛛网膜下腔置的管移植1次0.1 mL含1×107个／mL BMSCs(术后1W),B组2次(1、3W),C组3次(1、3、5W),D组5次(1、3、5、7、9W),E组为空白对照。3.植后1、3、5、7、9、12W评价实验动物的神经功能状况,相应时间点用荧光显微镜观察BMSCs在体内迁移、存活以及分化情况。HE染色、SABC免疫组化法检测Nestin、NF200、GFAP阳性表达情况。结果1.SCI后1W各组BBB评分均低于4分；3W后,各时间点BBB评分E组与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.01),5W后各时间点,A组评分有提高,但达到一个平台,功能恢复明显较C、D组慢,C、D组评分明显较B、A增加,有统计学差异(P<0.01)。但C、D组在各时间点比较无差异,无统计学意义(P>0.05)。2.荧光显微镜观察SCI后3W,移植的BMSCs存活于损伤脊髓损伤区及周围,并达到高峰,此后,A组细胞数逐渐减少,B、C、D组和A组一样,移植后升高,随后下降,7-12W各时间点,A、B组与C或D组比较差异有统计学意义(P<0.01),但C、D组在各时间点比较无差异,无统计学意义(P>0.05)。3.HE示术后3W,损伤的脊髓形成空洞,移植治疗后A、B、C、D组空洞逐渐减小,12W时,C组空洞最小,A、B组次之,E组最大,未见明显变化。4.1免疫组化显示NF200阳性细胞的变化趋势与BMSCs的细胞减少上基本-致,SCI后3W,NF200阳性细胞存活于脊髓损伤区及周围,并达到高峰,此后,A组细胞数逐渐减少,B、C、D组和A组一样,移植后NF200升高,随后下降,至12W时,NF200在C组中数量最多,表达最明显；在A组中可见到少量的NF200细胞,表达最弱；神经元样细胞发出的神经丝穿过损伤区在C组中也最明显,A组比较少,B组居中。4.2 E组Nestin阳性细胞在损伤1W后,在室管膜区、临近损伤区出现,3W后基本消失,治疗组A组在3W、B组在5WC、D组在7W后Nestin阳性细胞达到高峰,随后逐渐消失。4.3 E组GFAP阳性细胞在损伤1W后达到高峰,主要在损伤区及临近的广泛区域,后逐渐恢复到正常,7W后空洞边缘形成胶质瘢痕,A组GFAP阳性细胞在3W时达到高峰,B组在5W,C、D组在7W。至7W后,移植组胶质细胞逐渐重新排列,损伤处的胶质细胞突起之间开始相互编织,细胞肥大。此后,GFAP阳性细胞数逐渐减少,至12W,细胞仍肥大,GFAP阳性细胞间连接形成网状支架,其间有新生轴突穿过损伤区,以C组最为明显,B组次之,A组比较小。结论：1.采用密度梯度分离与细胞贴壁相结合的方法培养BMSCs,是一种简单可行的方法。依据Aellen’s改良方法建立的SCI模型是有效的。2.多次移植有利于提高损伤局部的BMSCs浓度,改善局部的微环境。移植3次组较其他组获得更好的功能恢复。3.免疫组化显示移植的BMSCs可以分化为神经前体细胞及神经元样细胞,相应的表达Nestin和NF200阳性。3次移植转化最多的神经元样细胞,发出神经丝穿过损伤区,修复损伤。GFAP阳性提示移植BMSCs有利于调整损伤局部胶质细胞的排列,阻止瘢痕的形成,在损伤区重行建立网状支架,有利于新生神经丝通过瘢痕区。4.总之,多次移植BMSCs可以提高SCI的功能,但3次为最好,这样经济、有效。移植BMSCs提高损伤局部的BMSCs浓度,改善局部的微环境,调节局部星形胶质细胞排列,形成网状支架,有利于新生神经丝穿过损伤区,减小空洞面积形成。这也可能是功能恢复的机理之一。