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背景:急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)及其更严重的形式急性呼吸窘迫综合症(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)是指机体在遭受到了感染、创伤与脓毒症等打击之后,肺组织产生的过度炎症性反应,其病理学特点为肺组织大量炎性细胞浸润、肺血管通透性增加。该病的发生机制复杂且病死率高,成为临床研究的一个焦点。ARDS以顽固性低氧血症为显著特征,表现为急性进行性呼吸困难。近年来,ARDS药物与非药物的联合干预治疗成为ARDS治疗的一个公认方向。但就治疗现状来看,多种药物的应用虽经研究证实能够改善短期的临床症状,但并不能提高远期生存率。因此,继续探索ARDS的发病机制以及开发相关药物,仍有现实的必要性。高迁移率族蛋白B1(HMGB1),最初被鉴定为核DNA结合蛋白,对转录调控和基因表达至关重要。此外,大量的临床和实验研究都表明细胞外HMGB1与ALI/ARDS的发病过程有特别紧密的关系。但是HMGB1释放的调节机制还未被阐明。缝隙连接蛋白(Connexin,Cx)家族有大约二十个成员,既能形成沟通细胞之间的缝隙连接,又能形成沟通细胞内外环境的半通道。这些通道可能在多种生理和病理过程中起重要作用。但由于缺乏选择性干扰Cx缝隙连接或者半通道功能的的手段,Cx半通道的功能一直未能明确建立。EL1P是一种自主设计的广谱选择性Cx半通道阻断剂。前期研究发现,EL1P能有效地抑制巨噬细胞(表达Cx43和Cx37)半通道通透性,但不干扰NIH3T3成纤维细胞Cx43磷酸化,缝隙连接的形成和功能(半通道选择性)。并发现EL1P能够选择性地抑制LPS引起的HMGB1从巨噬细胞的分泌,说明Cx半通道是调节HMGB1释放的重要环节。由于EL1P的氨基酸序列是不同Cx分子中比较保守的区域,可能对其它Cx形成的半通道也有抑制作用。所以我们将进一步确定其阻断Cx半通道的性质。另外,细胞外HMGB1在ALI/ARDS发病过程的重要作用,Cx半通道很可能通过调节HMGB1释放参与如ALI/ARDS等炎症性疾病的病理进程。目的确定EL1P阻断Cx半通道的广谱性,并利用EL1P研究Cx半通道在急性肺损伤的作用。方法:1.Cx半通道阻断剂的建立。基于缝隙连接蛋白家族第一细胞外环中高度同源的氨基酸序列设计的Cx模拟肽(EL1P),其氨基酸序列为ENVCYD。通过检测该模拟肽对肺微血管内皮细胞(PMVEC)、HepG2肝细胞和Cx43敲除的星状胶质细胞半通道的影响,确定其做为广谱选择性Cx半通道阻断剂的性质。2.使用人静脉血管内皮细胞(HUVEC),检测EL1P对LPS刺激后培养基内HMGB1的水平,从而确定EL1P对细胞释放促炎因子HMGB1的影响。3.检测EL1P对小鼠肺组织细胞半通道通透性的影响。通过腹腔注射细菌内毒素引发肺损伤20小时后,腹腔注射盐水(对照组)或EL1P(EL1P组),随后注射半通道示踪剂荧光黄,15分钟后通过肺循环灌洗固定肺组织,冰冻切片,DAPI染色,荧光显微镜下分别获取荧光黄和DAPI信号,ImageJ软件测量荧光黄和DAPI荧光面积。荧光黄/DAPI面积的比值反映肺细胞半通道通透性。4.半通道在急性肺损伤的作用。急性肺损伤由气管内注入LPS制备。在引发肺损伤后2和20小时分别通过腹腔注射生理盐水(对照组)或EL1P。随后观察或检测:小鼠死亡率,支气管肺泡灌洗液中HMGB1、IgM、ALT、AST和LDH水平,肺组织Cx37、Cx40和Cx43半通道蛋白水平,肺泡白细胞浸润等指标。5.实验数据使用Student’s T-test进行统计分析。下述实验结果的p值均小于0.05。结果:在培养条件下,EL1P能够显著抑制肺微血管内皮细胞、HepG2细胞和Cx43敲除的星状胶质细胞半通道的通透性。由于这些细胞表达不同的Cx,这些结果说明EL1P是一种广谱Cx半通道阻断剂。在体外,EL1P可以抑制HUVEC向细胞外释放HMGB1。在体内,EL1P不显著影响Cx37、Cx40和Cx43蛋白水平,但能降低肺细胞半通道通透性。延迟注射EL1P能显著提高急性肺损伤小鼠存活率,减轻肺泡白细胞浸润。EL1P组小鼠肺泡灌洗液内HMGB1、ALT、AST、LDH和IgM水平低于急性肺损伤对照组。结论:Cx半通道在急性肺损伤过程中起重要作用。EL1P是一种广谱Cx半通道阻断剂,通过阻断半通道介导的HMGB1释放保护肺组织,可能在治疗急性肺损伤和急性呼吸窘目的:迫综合征方面有潜在的应用价值。