L-谷氨酸氧化酶发酵条件及分离纯化的研究

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L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidise,简称GLOD)是80年代初开始发现的一种新酶,最早从蛇的毒液、鼠的肾脏、无脊椎动物和微生物等生物体中分离得到。它是以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的黄素蛋白酶类,对L-谷氨酸生成H2O2、氨和α-酮戊二酸有很好的专一性,食品、医药、发酵等领域都有广泛的应用,成为一种非常实用的工具酶。但是目前,国内对该酶的研究只是局限于产酶菌种发酵条件的优化和对GLOD粗品的生产,对GLOD纯品的制备非常少见,我们使用的GLOD纯品主要是由国外几家公司生产,价格非常昂贵,且偶有供货不及时的现象,很大程度上限制了该酶的广泛使用,因此GLOD纯品的国产化势在必行。本研究选用山东省科学院生物研究所保存的华美链霉菌(Streptomycessplendens4.666)菌株,经过复壮、活化,筛选出一株表现出高于其他菌株的产酶能力的菌株,并对其形态特性、生理生化特性进行了检测,作为GLOD的生产菌株进行下续的实验。为进一步提高该菌株生物活性的利用价值,该研究对菌株的生长与产酶条件进行了优化。分别利用响应面法进行了培养基组成优化和单因素试验法进行了培养条件优化。实验得到最佳培养基组成:3.0%葡萄糖,3.2%蔗糖,2.2%玉米浆,1.0%硫酸铵,1.0%谷氨酸钠,0.05%MgCl2,0.05%KCl,0.05%NaH2PO4,每个摇瓶加3%固体粉状CaCO3;最适培养条件:培养基初始pH值为6.7,装液量30mL,转化温度为28℃,转化时间48h,接种量3.0%,经验证:优化后GLOD产量明显提高,由9.56g/L提高到19.1g/L,是初始GLOD产量的2倍。利用Streptomyces splendens4.666发酵生成GLOD,设计出能达到较高纯度的GLOD的分离纯化路线。发酵液经过高速冷冻离心、硫酸铵分级沉淀、SephadexG-25脱盐、MonoQ离子交换、Superdex G-200凝胶层析及冷冻干燥等步骤得到纯化的GLOD。纯化后的GLOD比活力为176U/mg,纯化收率为12.95%,纯化倍数926倍。纯化后的GLOD经SDS-PAGE电泳为单一条带。SDS-PAGE和Superdex G-200凝胶层析分析显示为约140kDa的单链蛋白,说明该酶经过FPLC快速蛋白分离纯化系统,去除了大部分多糖杂质,纯度检测达到98.67%。最后,对GLOD的酶学特性和应用进行了研究。结果表明,该GLOD的pH稳定范围为0~50℃,最适pH和最适温度分别为pH7.0和50℃,该酶催化L-谷氨酸的米氏常数Km为2.1×10-4mol/L,大多数金属离子如Na+、K+、Mg2+对GLOD对酶活几乎没有影响,微量的Cu2+使酶活降低近50%,而Hg2+、Ag+则显著抑制了酶的活性。我们将浓缩脱盐后的酶液冻干,固定化制作成酶膜,应用于生物传感器中,并且与国外GLOD制成的酶膜活性相比较。因此,本文只是为我国生产商品化的GLOD做些理论上及实践上的初步探索,相比于国际化的商品酶,仍有较大距离。实际研究中,由于实验条件的限制,未能对该酶的部分氨基酸序列进行分析,另外,该菌株的中试生产研究也有待探索。对GLOD纯品的探索研究,既能为生物传感器开辟一个新的应用领域,又能降低耗材成本,节约外汇,促进生物传感分析仪的推广应用,具有极高的投资价值和市场潜力。
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