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目的:急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)是危重患者常见的临床并发症之一,其危害大,病死率高(50%~70%),可作为一项独立危险因素影响患者预后。AKI的病因是多因素的,但由脓毒症(sepsis)引起者可占50%以上。有研究表明脓毒症相关急性肾损伤的院内病死率可高达70.2%。回顾过去20年,尽管在治疗和研究技术方面取得了许多进步,但是对于脓毒症相关AKI患者的预后没有实质性改变,其病死率仍在不断增长!原因可能与我们对脓毒症相关急性肾损伤的发病机制了解不够,同时缺乏早期直观的生物学标志物及有效的治疗措施相关。因此探讨脓毒症性肾损伤的病理生理学机制已成为一热门话题。近年来一些人提出细胞凋亡在急性肾损伤中起重要作用,并有研究证明,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase酶)的广谱抑制剂或特异性拮抗剂能够改善缺血再灌注及中毒性肾损伤。在脓毒症相关AKI中,也有人研究发现其肾组织损伤以细胞凋亡为主,但这一观点也被许多人所质疑。因此凋亡在脓毒症相关急性肾损伤中是否起着关键作用还存在争议。凋亡可由多种应激原如炎症因子、缺血、氧化应激、紫外线等诱因作用下触发。Caspase酶级联反应在凋亡复杂过程的大多调制因子中,居于核心地位。而caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族(caspase家族)中关键酶之一,通常以无活性的酶原形式存在。活化后的caspase-3可使细胞质、细胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活。Ac-DEVD-CHO是一种人工合成的非生物性抑制剂,能竟争性与caspase-3结合阻断caspase-3对底物蛋白质的降解作用,从而抑制caspase-3介导的细胞凋亡,起到器官保护作用。本研究旨在采用盲肠结扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture, CLP)法复制脓毒症相关急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)模型,应用免疫组化法(immunohistochemisty)、流式细胞术(flow cytometry, FCM)等方法检测凋亡抑制剂Ac-DEVD-CHO对肾组织凋亡相关因子caspase-3、Bcl-2、Bax等蛋白表达的影响,探讨caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO对脓毒症急性肾损伤小鼠的肾保护性作用,并对其可能机制进行初步研究。方法:本研究采用盲肠结扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture, CLP)法复制小鼠脓毒症致AKI模型。健康清洁级雄性C57BL/6小鼠72只,随机分为3组(n=24),①假手术组(sham group):只开腹,翻动肠管,牵拉盲肠后关腹,不结扎和穿孔盲肠;②盲肠结扎穿孔组(CLP group):进行盲肠结扎穿孔术;③Caspase-3抑制剂早期干预组(Caspase-3 inhibitor group):先进行盲肠结扎穿孔术,术后30min立即给予4μg/g Ac-DEVD-CHO凋亡抑制剂溶于1%DMSO液中,腹部皮下注射。各组术后均给予37℃“生理盐水”30ml/kg股部皮下注射,并于术后3小时给予“亚胺培南西司他丁钠”25mg/kg,腹部皮下注射一次,然后以相同剂量Q12hr×2天。三组分别在术后6 h、12 h、24 h后通过摘眼球法采血(每组每个时间点各8只),各组取血标本离心后取血清于-80℃冻存,用于测定血清中的肌酐、尿素氮水平。同时取肾脏分为三部分,1/2左肾放入10%中性福尔马林中固定24至48小时后石蜡包被,用于光镜检测及病理损伤评分;另外1/2左肾放入4%多聚甲醛中固定24至48小时后石蜡包被,用于免疫组化法检测caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达及定位;右肾放入70%的乙醇中固定24至48小时,用于流式细胞术检测肾细胞凋亡率以及Bax、Bcl-2蛋白表达。数据统计分析采用SPSS13.0版软件包(SPSS Company, Chicago,Illinois,USA)进行;数据均以均数±标准差(χ±s)表示,多个独立样本非参数检验采用Kruskal-Wallis H检验;多个样本均数间比较采用完全随机设计的单因素方差分析,多个均数间两两比较采用LSD-t检验或S-N-K检验,方差不齐用对数转换和Kruskal-Wallis H检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1实验动物一般情况和肾脏大体形态的观察Sham组小鼠术后很快清醒且活动灵活;可自由饮水、进食;皮毛顺滑,双眼分泌物少或无;剖腹可见腹腔结构清晰,无异常腹水及恶臭味,肠管表面光滑湿润。CLP组小鼠术后苏醒延迟且精神萎靡,活动迟缓;进食较少;竖毛明显,双眼分泌物较多。剖腹可见淡血性腹水量多,有恶臭;肠管水肿充血,腹腔肠管结构不清,组织粘连,部分盲肠末端发黑。CI组小鼠术后一般情况介于前两者之间。Sham组肾脏颜色红润,色泽较暗;CLP组肾脏水肿充血明显,色泽鲜红;CI组肾脏略水肿,充血较CLP组不明显,色泽介于前两者之间。2组织病理变化(HE染色)及肾脏组织损伤病理评分结果肾脏组织病理变化(HE染色):sham组:光镜下肾组织形态基本正常;CLP组:肾小球及肾小管明显充血,肾小管上皮细胞体积增大,胞浆内可见明显空泡变性和玻璃样变性,并伴有炎细胞浸润;CI组:肾小管上皮细胞损伤较CLP组明显减轻,少量细胞出现轻微肿胀、脱落及空泡变性,肾小管形状保持较好。肾脏组织损伤病理评分结果:术后6h CLP组病理损伤评分明显高于sham组及CI组(P<0.01),而后两者间无统计学差异(P>0.05);术后12h、24h均有相似结果(P<0.05)。sham组、CLP组、CI组各组内病理损伤评分随时间呈下降趋势,但均无统计学差异(P>0.05)。3各组小鼠肾功能血清Cr及BUN结果术后6h Cr值CLP组较sham组明显升高(P<0.01);CI组明显降低了CLP组升高的Cr值(P<0.01),与Sham组相比无统计学差异(P>0.05)。术后12h及24h sham组、CLP组和CI组三组任意两者Cr值均无统计学差异(P>0.05)。Sham组与CLP组Cr在术后6h、12h、24h随时间呈下降趋势,但无统计学差异(P>0.05)。CI组Cr值术后随时间也呈下降趋势,且术后24h较6h下降明显(P<0.05)。术后6h BUN值CLP组较sham组明显升高(P<0.05);CI组明显降低了CLP组升高的BUN值(P<0.05),与Sham组相比无统计学差异(P>0.05)。术后12h CLP组BUN值较sham组升高(P<0.05),其余任意两组无统计学差异(P>0.05)。术后24hBUN值任意两组间均无统计学差异(P>0.05)。Sham组内BUN在术后6h、12h、24h随时间呈下降趋势,但无统计学差异(P>0.05)。CLP组BUN在术后12h较6h、24h增高,但三者无统计学差异(P>0.05)。CI组与CLP组有相似结果。4各组肾组织细胞凋亡率检测结果术后6h肾小管上皮细胞凋亡率CLP组较sham组明显升高(P<0.01),CI组明显降低了CLP升高的细胞凋亡率(P<0.01),与sham组相比也显著升高(P<0.01)。术后12h及24h有相似结果。Sham组内肾小管上皮细胞凋亡率在术后6h、12h、24h随时间有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05);CLP组随时间也呈下降趋势,且24h与6h相比明显下降(P<0.01);CI组随时间呈明显下降趋势,且任意两组间有显著差异(P<0.01)。5各组凋亡相关因子肾组织Bcl-2及Bax检测结果术后6h Bcl-2蛋白表达在CLP组、CI组均较sham组有增高趋势,但无明显差异(P>0.05);而术后12h、24h三者Bcl-2蛋白表达CLP组较sham组明显增高(P<0.01),而CI组在CLP增高的基础上又明显增高(P<0.01)。Sham组内Bcl-2在术后6h、12h、24h无统计学差异(P>0.05)。CLP组内Bcl-2在术后12h、24h较6h蛋白表达增高(P<0.01),24h较12h无明显差异(P>0.05);CI组与CLP组有相似结果。术后6h Bax蛋白表达CLP组较sham组呈增高趋势,但无统计学差异(P<0.05),CI组明显降低了CLP组升高的Bax表达(P<0.01); 12h、24h CLP组较sham组明显增高(P<0.01),其余结果与6h相同。Sham组内Bax在术后6h、12h、24h无明显差异(P>0.05);CLP组内Bax在术后12h、24h较6h表达均明显增高(P<0.01),24h较12h也明显增高(P<0.01);CI组与CLP组有相似结果。6各组免疫组化肾组织凋亡相关caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达结果Caspase-3蛋白术后24h阳性表达在sham组肾组织较少;而在CLP组胞浆中有较高表达,以肾小管细胞为主;CI组表达较CLP组明显减少,且有统计学差异(P<0.05),而sham组与CI组相比无统计学差异(P>0.05)。Bcl-2蛋白术后24小时阳性表达在sham组肾组织甚微;而在CLP组胞浆中有较高表达,CI组表达较CLP组明显增高,三者呈递增趋势。且任意两组比较均有统计学差异(P<0.05)。Bax蛋白术后24小时阳性表达在sham组肾组织较少;而在CLP组胞浆中有较高表达(P<0.05),CI组表达较CLP组明显降低(P<0.05),较sham组变化不明显(P>0.05)。结论:1凋亡是脓毒症导致急性肾损伤的一个重要机制;2 Caspase-3作为凋亡途径的关键酶在脓毒症导致急性肾损伤的过程中起着重要作用;3 Ac-DEVD-CHO通过抑制肾组织caspase-3蛋白表达从而减少肾小管上皮细胞的凋亡,起到肾保护性作用。