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结核分枝杆菌早期分泌性6kDa靶抗原(ESAT-6)是从结核分枝杆菌早期培养滤液蛋白中分离出的一种小分子量蛋白,可刺激机体产生较强的免疫应答。ESAT-6蛋白由结核分枝杆菌RD1区(此段区域在所有BCG菌株中均缺失)基因Rv3875(也称esxA)编码,有95个氨基酸,不含信号肽,是一种非信号肽依赖的结核分枝杆菌分泌性小分子量抗原。ESAT-6蛋白具有T细胞和B细胞的抗原决定簇,可同时引起细胞和体液免疫应答,其中细胞免疫是主要的应答反应机制。ESAT-6蛋白可刺激机体产生强烈的T细胞免疫应答,并释放高水平的IFN-γ,是结核分枝杆菌感染早期阶段宿主细胞识别的主要靶抗原,因而成为新型疫苗和诊断试剂的理想最佳候选抗原之一。高特异性和敏感性的抗体对于ESAT-6蛋白的研究与应用是不可或缺的,但ESAT-6蛋白自身分子量较小且B细胞表位十分有限,这给利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备其特异性单克隆抗体带来一定的困难。本研究以纯化的重组融合蛋白His-CFP10-ESAT-6(简称rHis-CE)为免疫原免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,以纯化的重组融合蛋白GST-ESAT-6(rGST-ESAT-6)为检测原,应用B淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA检测和3次亚克隆,获得了3株稳定分泌结核分枝杆菌ESAT-6蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4E1、4D7和4G8。对制备的3株单抗进行效价测定以及亚类和特异性的鉴定,结果显示,3株单抗亚型均为IgGl型,细胞培养上清效价均在104以上,其中4G8可达105,腹水效价都在107以上。应用间接ELISA试验测定了单抗的特异性,结果显示,3株单抗均只与不同形式的ESAT-6重组融合蛋白及结核分枝杆菌H37Rv中的ESAT-6抗原发生特异性反应,而与不含ESAT-6抗原的BCG菌株无交叉反应。Western Blotting鉴定结果显示,3株ESAT-6特异性单克隆抗体均可与rHis-CE和rGST-ESAT-6以及结核分枝杆菌H37Rv中的ESAT-6蛋白发生特异性反应,出现与目的蛋白大小一致的特异性条带,而与重组菌pET-30a/BL21(DE3)和pGEX-6p-1/BL21以及BCG疫苗株无特异性反应。通过间接ELISA和竞争ELISA试验对3株单抗识别的抗原表位进行鉴定,结果显示,3株ESAT-6特异性单克隆抗体仅与ESAT-6蛋白1-20位氨基酸多肽发生特异性反应。将构建的重组真核表达质粒pCMV-HA-ESAT-6转染HEK293T细胞,利用3株ESAT-6特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,可观察到明显的荧光,表明ESAT-6蛋白可在真核细胞内表达。通过Pull Down试验,利用rGST-CFP10蛋白从结核分枝杆菌H37Rv和表达rHis-ESAT-6蛋白的大肠杆菌裂解液中捕获ESAT-6蛋白。利用ESAT-6单抗对捕获结果进行Western blotting鉴定,结果显示,ESAT-6单抗可检测到从结核分枝杆菌H37Rv和重组大肠杆菌中捕获到的ESAT-6和rHis-ESAT-6蛋白,出现特异性条带。综上所述,本研究成功制备了3株稳定分泌结核分枝杆菌ESAT-6特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单抗不仅可特异性检测原核表达系统和真核表达系统表达的重组ESAT-6蛋白,还可特异性识别结核分枝杆菌H37Rv中的ESAT-6抗原,具有较好的特异性和免疫反应性。ESAT-6特异性单克隆抗体的成功制备不仅提高了天然及重组结核分枝杆菌ESAT-6抗原纯化与鉴定的方法和效率,为ESAT-6的相关研究创造了良好的条件,更为结核分枝杆菌和结核病的检测、诊断研究以及各种新型疫苗和诊断试剂的研发提供了重要生物材料。