细菌常以一种群体生活方式来面对外界不利的生活环境,它们能够粘附到生物材料表面或者机体表面,生长形成致密的生物膜,此类感染能抵御抗生素的治疗,和机体自身免疫系统的清除。表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌是在植入性医疗材料上引起的生物膜相关感染的常见病菌。表皮葡萄球菌的致病性虽然比金黄色葡萄球菌要弱,但由于能够形成厚而致密的生物膜,也已成为院内感染的主要条件致病菌。葡萄球菌生物膜引起多重耐药机制复杂,生物膜内细菌的代谢率和生长速率低,对抗生素的敏感性差；生物膜基质能降低抗生素在生物膜内的渗透使其中的细胞减少在抗生素环境内的暴露。现存的大多数抗生素都不能有效地穿透生物膜,或者因对材料表面附着和代谢率低的细菌杀伤作用有限而不能有效地应对生物膜相关感染。研发新的用于治疗葡萄球菌生物膜相关感染的药物变得尤为迫切。治疗由葡萄球菌引起的生物膜感染有以下几种策略：调节生物膜形成过程中发挥重要作用的调控系统,如双组分系统,群体感应系统；降解生物膜内的胞间基质以解聚细菌；开发新一代的抗生素,抗菌药物的新联合应用。细菌的双组分系统在细菌的生长过程中发挥重要作用,是开发新的抗菌药物的理想靶标。本研究共分为三章,第一章主要研究噻唑烷酮类化合物Compound 2衍生物抗表皮葡萄球菌活性；第二章主要研究噻唑烷酮类化合物Compound 5衍生物及其抗菌/生物膜活性；第三章对表皮葡萄球菌组氨酸激酶YycG抑制剂的作用机制进行了初步的研究。在本课题中,我们对筛选出的新合成的衍生物的细胞毒性,体内抗生物膜活性、对临床菌株的抗菌活性进行评估,为开发出新型抗菌谱广、毒性低且具有自主产权的新型的抗葡萄球菌感染药物奠定基础。第一章 噻唑烷酮类化合物Compound 2衍生物抗表皮葡萄球菌活性的研究葡萄球菌是医院获得性感染的重要致病菌,并且在临床病例中有较高的致死率和致残率。引起院内感染的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌株大部分都是耐药菌株。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌株能够粘附到生物材料表面或者机体表面,生长形成致密的生物膜,更是加剧了抗生素的治疗的困难。在本实验室的前期工作中,以YycG组氨酸激酶HATPase_c功能域作为候选抗菌药物靶点,通过高通量虚拟筛选,获得了小分子抑制剂Compound 2(3-苯基-5-苯亚甲基-2-苯氨基-4-噻唑酮)。其对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑菌活性和抗生物膜形成作用,且与药靶蛋白具有很好的亲和力并可抑制YycG蛋白磷酸化的活性。在先导化合物噻唑酮母核的基础上,对其活性基团进行拼接、增长或缩短碳链、生物电子等排、断裂和开环等方式,进行结构优化改造,共设计合成了衍生物共95个。通过生物学实验,检测YycG小分子抑制剂改造化合物的活性,筛选出有较强抑菌活性及抗生物膜作用的化合物。评估了筛选出的6个衍生物的抗菌活性,包括MIC,杀菌活性,抗生物膜活性,抑制YycG蛋白磷酸化活性,细胞毒性,在新西兰白兔皮下表皮葡萄球菌生物膜感染模型中的体内活性。第二章噻唑烷酮类化合物Compound 5衍生物筛选及其抗菌/生物膜活性的研究在本部分实验中我们采用与改造Compound 2相同的思路,通过改变Compound5双萘手性磷酸催化剂为主要手段,采用较为简便有效的合成光学纯的方法,设计和合成新的Compound 5衍生物以增强其抗菌活性。设计和合成了新的Compound 5衍生物19个,加上前期报道的20个,共计合成Compound 5衍生物39个。通过生物学实验对这些合成的新的Compound 5衍生物的体外抗菌活性进行了检测,从中选取7个具有良好抑菌杀菌活性的衍生物:H5-23, H5-24,H5-25,H5-32, H5-33,H5-34和H5-35。首先对噻唑烷酮类化合物Compound 5的结构改造及筛选/作用靶标分析及验证,重点对Compound 5改造过程中的基团变化及所获得的衍生物的抑菌活性,分析其构效关系。然后对挑选出的噻唑烷酮类化合物Compound 5衍生物的抗菌活性与抗生物膜活性检测,检测了其对早期生物膜(6 h)和成熟生物膜(24 h)的抑制作用。通过激光共聚焦显微镜和扫描电镜,评估了该系列衍生物对生物膜内的细菌的杀伤效果,并将其与其他常用抗生素的联合应用,评价联用后是否能够增强抗菌效果。最后对噻唑烷酮类化合物Compound 5衍生物耐药菌株的产生及其可能机制的探究。通过将表皮葡萄球菌ATCC35984在亚抑菌浓度的衍生物H5-10内连续传代30次,获得疑似耐药菌株,并对其可能的耐药机制进行初步的研究。第三章表皮葡萄球菌组氨酸激酶YycG抑制剂的作用机制细菌在生长过程中能够从环境中获得各种信号来调控自身相关基因的表达,从而能够更好的适应环境。细菌生长和生物膜的形成受到双组分信号转导系统(two-component signal transduction systems, TCS)的调控。双组分信号转导系统作为一种重要的信号转导途径广泛存在于原核生物中,主要由组氨酸蛋白激酶和反应调节蛋白两种蛋白质组成,而哺乳动物(包括人类)不存在,因此TCS可做为新型抗菌/抗生物膜药物的靶标[1]。研究表明双组分信号转导系统YycG/YycF广泛存在于革兰阳性细菌中(如葡萄球菌、枯草杆菌、链球菌等),并与细菌生长密切相关,为细菌存活所不可缺少,被认为是潜在的药物靶标。其中组氨酸蛋白激酶(如YycG)是跨膜蛋白,当外界信号与其膜外配体结合后可使其自身磷酸化；而反应调节蛋白(如YycF)是胞质蛋白,其调控区域能与磷酸化的组氨酸蛋白激酶相互作用,发生磷酸化后构象改变从而暴露相应的DNA结合位点,再结合不同的DNA序列,进行一系列的调控反应[2,3]。YycG/YycF对表皮葡萄球菌生长和生物膜的形成发挥十分重要的调控作用,然而其调控机制尚不清楚。在本实验室的前期工作中,筛选到针对表皮葡萄球菌YycG/YycF双组分信号转导系统中YycG组氨酸激酶的抑制剂,发现该类抑制剂不仅对浮游状态的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌具有较强的杀菌活性,而且可以破坏表皮葡萄球菌形成的生物膜、杀灭包被于生物膜内的细菌[4-6]。本部分课题一方面根据生物信息学预测的YycG/YycF可能调控的与葡萄球菌生长和生物膜形成相关的下游基因,通过使用YycG抑制剂(Compound 2衍生物H2-81)检测其对表皮葡萄球菌YycGF系统下游基因转录水平的影响。另一方面用实验室已构建yycG和yycF沉默表达载体,对YycG和YycF进行沉默,观察沉默后表皮葡萄球菌表型和下游基因转录水平的变化。以期能验证小分子抑制剂对作用机制进行说明,为阐明YycG/YycF对细菌生长和生物膜形成的调控机制奠定一定的基础。