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布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella.app)引起的人畜共患病,流行较广,危害巨大,主要造成波状热和慢性感染,引起流产和不孕不育,严重危害了人类健康和畜牧业发展。目前研究较多的布鲁氏菌疫苗主要有灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗,但灭活疫苗引起免疫效果差,减毒活疫苗又存在接种后出现强烈副反应、免疫与感染的难以鉴别,以及个别情况下出现菌毒回升等缺点,因此寻找有效的布鲁氏菌亚单位疫苗已成为研究重点。本研究通过PCR扩增得到L7/L12和Omp16基因片段,构建了原核表达质粒pET-28a-L7/L12和pET-28a-Omp16,经IPTG诱导表达后得到rL7/L12蛋白和rOmp16蛋白。Overlap PCR扩增L7/L12-Omp16融合基因片段,构建真核表达质粒pVAX1-L7/L12-Omp16,转染293T细胞后进行间接免疫荧光检测,结果显示,该DNA疫苗可在真核细胞中高效表达。同时,构建pMV306-L7/L12-Omp16重组质粒,电转化至BCG感受态细胞制备重组BCG载体疫苗,Western Blot验证结果表明,L7/L12-Omp16融合蛋白能在BCG中正确表达。将基于L7/L12和Omp16蛋白的重组蛋白疫苗、DNA疫苗和载体疫苗采用不同免疫方案对BALB/c小鼠进行免疫,进行免疫原性分析。通过ELISA检测血清中IgG、IgG1和IgG2a抗体水平,结果表明DNA-Protein组的抗体效价最高,rBCG组和rBCG-DNA组的抗体效价较低,说明DNA-Protein的免疫策略能增强机体的体液免疫应答水平,而载体疫苗诱导机体产生的体液免疫水平较弱。对小鼠脾淋巴细胞进行CCK-8和Proliferation Dye eFlour~TMM 450染色检测各免疫组脾淋巴细胞的增殖活性,结果显示,DNA-Protein组和rBCG-DNA组的的免疫策略能增强淋巴细胞的增殖活性。FCM检测CD4~+T和CD8~+T细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-17的分泌量,结果表明DNA疫苗和载体疫苗免疫组中IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-17的含量显著高于PBS组,证明DNA疫苗和载体疫苗均能诱导机体产生较强的细胞免疫应答,且DNA-Protein组和rBCG-DNA组的免疫策略能增强机体的细胞免疫应答水平。对各免疫组分泌IFN-γ的细胞进行ELISPOT检测,结果与FCM检测IFN-γ的结果一致,即DNA-Protein组和rBCG-DNA组的免疫策略能增强机体的细胞免疫应答水平。综上所述,本试验构建了布鲁氏菌L7/L12和Omp16蛋白的重组蛋白疫苗、DNA疫苗和载体疫苗,通过不同的免疫方案对BALB/c小鼠进行免疫,DNA疫苗和载体疫苗均能诱导机体产生较强的细胞免疫,但体液免疫较弱。相比于使用单一疫苗,DNA-Protein和rBCG-DNA的免疫策略能增强机体的体液免疫和细胞免疫应答水平。