乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中由核糖体合成的具有抗菌作用的多肽或蛋白质,具有安全、容易降解、无毒副作用和无耐药性等优点。Plantaricin NC8由两条寡肽PLNC8α和PLNC8β组成,属于Class Ⅱb类乳酸菌细菌素,两条寡肽通过协同作用可以抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,且其热稳定性良好,安全无毒副作用,在食品、医药及农业等领域均具有相当大的应用价值及应用前景,对其抑菌机制的研究在今后的开发应用中具有重要意义和价值。本研究采用固相合成法合成Plantaricin NC8,研究其抑菌谱,探索Plantaricin NC8抑制藤黄微球菌的作用机制,寻找Plantaricin NC8可能的特异性作用靶点。具体内容如下:1.Plantaricin NC8抑菌谱和最小抑菌浓度（MIC）的测定。采用固相合成法合成了 Plantaricin NC8α和Plantaricin NC8β两条寡肽,检测抑菌活性发现Plantaricin NC8能够抑制多种革兰氏阳性菌及少数革兰氏阴性菌。其中,藤黄微球菌对Plantaricin NC8最为敏感,最小抑菌浓度（MIC）稳定在800 nM。2.温度、pH及酶对Plantaricin NC8稳定性的影响。在60～121℃下处理 30 min,Plantaricin NC8 依旧保持活性,表明 Plantaricin NC8的热稳定性良好。在酸性条件下,Plantaricin NC8的抑菌活性良好,在pH范围为3-6时其活性最高（P＞0.05）,当pH大于6时,其抑菌活性显著降低（P＜0.05）。在对酶的耐受性研究中发现,Plantaricin NC8对α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶敏感（P＜0.05）,而对溶菌酶、脂肪酶、α-淀粉酶、核糖核酸酶A和蛋白酶K不敏感（P＞0.05）。3.Plantaricin NC8对藤黄微球菌的作用模式研究。以藤黄微球菌为指示菌,经过Plantaricin NC8处理的细胞,其跨膜电势差（ΔΨ）和细胞质子浓度梯度（ApH）迅速耗散,胞外电导率迅速上升,胞内ATP合成受到抑制。对经Plantaricin NC8处理后的藤黄微球菌进行扫描电镜与透射电镜观察发现,细菌素处理后的细胞表面与剖面结构及形态均发生了明显改变。实验结果说明Plantaricin NC8可以使藤黄微球菌细胞膜发生破损,内容物外泄,最终导致细胞死亡。4.Plantaricin NC8与Lipid Ⅱ的结合作用研究。通过抑菌圈实验和荧光泄露实验分析Plantaricin NC8与Lipid Ⅱ的结合作用发现,与阳性对照Nisin的实验结果不同,Lipid Ⅱ并没有对Plantaricin NC8的抑菌活性造成影响,表明常见的细菌素作用靶点Lipid Ⅱ并不是细菌素Plantaricin NC8的特异性作用靶点。5.GST pull-down实验寻找Plantaricin NC8的特异性作用靶点。提取藤黄微球菌的细胞膜,通过抑菌圈实验分析Plantaricin NC8与细胞膜的结合作用,发现细胞膜抑制了 Plantaricin NC8的抑菌活性。可能的原因有静电作用、细菌素与膜上蛋白特异性结合及细菌素与膜上脂质发生作用。为探究细胞膜蛋白中是否存在细菌素Plantaricin NC8的作用靶点,提取了细胞膜蛋白并利用GST pull-down实验寻找膜蛋白中可能存在的作用靶点。将寡肽PLNC8α和PLNC8β的DNA序列克隆至表达载体pGEX-6P-1中,与GST基因融合,成功构建了重组质粒 pGEX-6P-1-plnc8α和pGEX-6P-1-plnc8β,将其转入受体菌E.coli Rosetta-gami2（DE3）pLysS中,实现可溶性融合蛋白GST-PLNC8α和GST-PLNC8β的表达。将融合蛋白GST-PLNC8α和GST-PLNC8β固定在谷胱甘肽-琼脂糖树脂上,充当诱饵蛋白来捕获膜蛋白中可能存在的作用靶点,利用iTRAQ技术进行分析,分别捕获到4个可能与寡肽PLNC8α特异性结合的膜蛋白和1个可能与寡肽PLNC8β特异性结合的膜蛋白。