脑胶质瘤是指起源于中枢神经系统神经胶质细胞的肿瘤,除极少数低级别胶质瘤(如毛细胞星形细胞瘤)患者可以通过外科手术治愈外,大部分恶性胶质瘤患者尽管接受手术、放疗和化疗,仍难以避免复发,给社会及患者家庭带来巨大经济负担和灾难性后果。对于脑胶质瘤发病机制的研究已经从组织病理水平逐渐深入到对肿瘤关键驱动基因和分子靶点进行研究,其中主要包括了基因的变异、等位基因的杂合性缺失、肿瘤细胞信号转导通路失调以及肿瘤微环境改变等方面。经典遗传学说认为,肿瘤是癌基因激活、抑癌基因失活的结果,代谢异常不过遗传事件诱发肿瘤的伴随现象。尽管人类基因组计划、癌症基因组图谱使科学家们获得了大量恶性胶质瘤的遗传学信息,然而恶性肿瘤的治疗并没有像预想中那样取得突破性进展。最近研究发现,细胞能量代谢失控是恶性肿瘤发生的关键环节,有氧糖酵解不是细胞癌变的结果,其本身就是一个癌性事件,这使很多研究者的目光重新聚焦到肿瘤代谢紊乱的研究上来,恶性肿瘤代谢异常有可能成为癌症诊断和治疗的新靶标。近年来越来越多的证据显示,很多癌基因或抑癌基因,都直接或间接参与代谢重编程,肿瘤代谢重编程一方面可以维持肿瘤细胞必须的能量供应,另一方面还可以促进肿瘤增殖、侵袭所需要的生物大分子物质的合成。不同肿瘤其代谢模式可能存在很大程度的差异,目前对于胶质瘤代谢紊乱的认识仍然停留在初级阶段。因此,进一步探索胶质瘤发生发展的分子机制,为胶质瘤治疗寻找新的靶点是当前神经肿瘤科学研究迫切需要解决的问题。目前研究发现ALDH1A3是胶质瘤干细胞生物标志物,ALDH1A3的表达与ALDH的活性一致,只有敲低ALDH1A3而不是其他亚型,才能明显降低ALDH的活性,ALDH1A3表达下降后可以明显增加ALDH+恶性肿瘤细胞对化疗药物(替莫唑胺、阿霉素和紫杉醇)的敏感性,ALDH1A3可能通过糖酵解途径驱动肿瘤的生长,抑制该酶可能会给高级别胶质瘤的治疗提供一个有前途的方法。然而,ALDH1A3调控的关键分子是什么,ALDH1A3是通过什么途径参与胶质瘤代谢重编程仍是悬而未决的问题。本研究为了阐述ALDH1A3在胶质瘤中的作用机制及功能,通过焦磷酸测序检测胶质瘤组织ALDH1A3基因启动子甲基化情况,免疫组织化学及Western-Blot检测ALDH1A3蛋白在不同级别胶质瘤组织及正常脑组织中的表达情况,实时荧光定量PCR的方法检测胶质瘤细胞系U87和U251中ALDH1A3的表达,并分析ALDH1A3启动子甲基化与蛋白表达是否相关以及二者与患者预后之间的关系。随后,采用慢病毒载体干扰技术,敲低胶质瘤U87细胞中的ALDH1A3基因,建立裸鼠脑胶质瘤原位移植模型,通过检测细胞增殖能力、凋亡水平、细胞周期、线粒体膜电位、细胞内ATP水平、葡萄糖消耗和糖酵解关键酶表达,研究ALDH1A3下调后生物学功能改变的情况,进一步通过高通量转录组测序,研究ALDH1A3基因下调后差异基因表达,进行生物信息学分析及验证。第一部分 胶质瘤中ALDH1A3启动子甲基化及蛋白表达情况的鉴定目的:基因启动子甲基化被认为是恶性肿瘤发生及演化中的重要表观遗传学调控手段,研究胶质瘤组织中ALDH1A3基因启动子甲基化状态与ALDH1A3蛋白表达相关性,并且探讨ALDH1A3与胶质瘤临床病理关系及其在预后评估中的意义。方法:1.115例脑胶质瘤临床样本及12例正常脑组织标本来源于昆明医科大学第二、第三附属医院神经外科手术切除标本,依据2007年WHO中枢神经系统肿瘤病理分级获得明确的胶质瘤病理诊断,所有患者均进行随访;2.应用免疫组织化学法对115例胶质瘤和12例正常脑组织的ALDH1A3表达情况与临床病理因素关系进行分析;3.分别选取低级别、高级别胶质瘤样本和正常脑组织样本各2例,通过Western-Blot检测胶质瘤组织中ALDH1A3蛋白的表达;4.通过焦磷酸测序对115例胶质瘤标本和12例正常脑组织进行ALDH1A3启动子甲基化检测,分析甲基化状态与临床病理学因素的关系,并进行生存分析,研究ALDH1A3表达与患者预后关系。5.体外培养胶质瘤细胞系U251和U87,进行细胞免疫组化研究ALDH1A3在胶质瘤细胞U251和U87中表达,提取总RNA,反转录成cDNA,通过qPCR检测ALDH1A3相对表达量,为慢病毒干扰实验提供依据。结果:1. ALDH1A3在胶质瘤中高表达我们通过焦磷酸测序检测检测115例胶质瘤组织和12例正常脑组织的ALDH1A3启动子甲基化状态,结果发现胶质瘤组织中ALDH1A3甲基化水平(36/115,31.3%),与正常脑组织(1/12, 8.3%)相比,胶质瘤组织中ALDH1A3水平增高(p<0.001);通过免疫组织化学方法研究ALDH1A3的表达和亚细胞定位,结果发现115例胶质瘤标本和12例正常脑组织标本中,ALDH1A3主要表达于细胞膜和细胞浆中,在胶质瘤组织中的阳性率(79/115, 68.7%),较正常脑组织阳性率(1/12,8.3%)增高(p<0.001),ALDH1A3启动子甲基化状态与蛋白表达负相关。2.ALDH1A3在胶质瘤中的表达与病理分级呈正相关,与患者的年龄、性别不相关,ALDH1A3表达是胶质瘤独立预后因素。3.胶质瘤U87细胞和U251细胞中均有ALDH1A3表达,主要定位于细胞浆和细胞膜,qPCR检测发现U87细胞中ALDH1A3 mRNA表达量比U251细胞高。结论:1.胶质瘤组织存在ALDH1A3启动子甲基化及ALDH1A3蛋白异常表达,ALDH1A3启动子甲基化与蛋白表达负相关,ALDH1A3表达水平随胶质瘤恶性级别的升高而增高,ALDH1A3启动子甲基化及ALDH1A3蛋白表达均可作为评价胶质瘤级别的辅助指标。2.胶质瘤组织中ALDH1A3启动子甲基化及ALDH1A3蛋白表达与患者无进展生存和总生存时间密切相关,ALDH1A3启动子甲基化比非甲基化患者的无进展生存和总生存时间延长;ALDH1A3蛋白表达阴性比阳性患者无进展生存和总生存时间延长,提示ALDH1A3表达水平可作为患者预后的独立预测指标。3.ALDH1A3在U87和U251细胞中表达水平有差异,U87细胞为ALDH1A3相对高表达细胞株。第二部分ALDH1A3基因沉默对人脑胶质瘤U87株生物学行为影响目的:通过慢病毒介导的RNA干扰技术,下调胶质瘤U87细胞株ALDH1A3基因的表达,并研究ALDH1A3基因敲低后,细胞生物学行为及糖酵解关键酶的改变。方法:1.构建ALDH1A3-shRNA及Scramble-shRNA (阴性对照组)慢病毒表达载体,测序鉴定、慢病毒包装后转染到U87细胞,用实时荧光定量和Western-blot检测ALDH1A3干扰后mRNA和蛋白表达,通过嘌呤霉素筛选稳定干扰细胞株;2.稳定干扰ALDH1A3表达后,CCK8实验检测细胞增殖的变化,Transwell实验检测细胞侵袭能力变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期变化,JC1检测线粒体细胞膜电位改变,ATP检测试剂盒测定细胞内APT含量,Glucose HK Assay试剂盒测定细胞葡萄糖消耗,Western-Blot检测糖酵解关键酶PKM2及HK2的蛋白表达。3.将ALDH1A3-shRNA的U87细胞、阴性对照和空白对照U87细胞接种于裸鼠脑组织,进行原位脑移植成瘤实验,通过HE染色及Western-Blot检测裸鼠脑内成瘤及ALDH1A3表达情况,并通过生存分析研究ALDH1A3-shRNA对裸鼠总生存时间的影响。结果:1.重组慢病毒ALDH1A3-shRNA及Scramble-shRNA(阴性对照)测序结果正确,慢病毒成功包装后转染U87细胞效率高。2.通过慢病毒转染下调胶质瘤U87细胞ALDH1A3表达,可以发现以下生物学行为改变:ALDH1A3基因表达水平和蛋白质表达水平显著下降、细胞增殖下降、细胞凋亡增加、细胞周期阻滞于G2/M期、体外侵袭能力下降、线粒体膜电位JC-1下降、细胞内ATP下降、葡萄糖消耗增高以及糖酵解代谢关键基因PKM2及HK2表达下调。3.与对照组相比,ALDH1A3-shRNA组裸鼠脑原位移植肿瘤体积缩小,HE染色显示肿瘤细胞数量和核分裂相明显减少,生存分析发现ALDH1A3-shRNA组裸鼠总生存时间延长,提示裸鼠脑胶质瘤原位移植模型成功建立。结论:下调ALDH1A3基因的表达,可以有效抑制细胞增殖和侵袭能力,导致细胞凋亡增加、细胞周期G2/M期阻滞以及能量代谢的核心细胞器线粒体膜电位、细胞ATP水平下降,葡萄糖消耗增加以及糖酵解代谢相关基因PKM2及HK2表达下调,这些结果提示ALDH1A3基因可能通过能量代谢、糖酵解代谢途径参与神经胶质瘤的发生、发展过程。第三部分转录组测序研究ALDH1A3下调前后基因表达及生物信息学分析目的:通过高通量转录组测序分析ALDH1A3-shRNA的U87细胞差异基因表达,研究ALDH1A3基因在胶质瘤中的作用。方法:构建cDNA文库后,应用RNA-seq技术检测沉默ALDH1A3基因前后的U87胶质瘤细胞的转录组中差异基因表达,采用FPKM来估算样本中的基因表达量,筛选基因表达差异倍数≥2的差异表达基因(DEGs)。应用GO方法分析差异表达基因的功能聚类;应用KEGG对差异基因涉及到的信号通路进行富集分析;构建蛋白质相互作用网络,筛选差异表达基因网络中关键蛋白,通过Western-Blot方法进行验证。结果:U87胶质瘤细胞ALDH1 A3基因干扰前后的转录组共有104个差异表达基因,包括33个表达一致上调的基因、71个表达一致下调的基因,104个差异基因被分为24个功能聚类。我们通过KEGG信号通路分析,发现ALDH1A3干扰前后的差异表达基因富集到8条信号通路上(p<0.05): (1)调节细胞侵袭;(2)凋亡信号通路;(3)FoxO信号通路;(4)糖酵解/糖原合成信号通路;(5)代谢相关信号通路;(6)Jack-STAT信号通路;(7)视黄醇代谢;(8)DNA剪切修复。根据蛋白质相互作用网络分析的结果,我们发现4个重要差异表达基因:PKM2, STAT6,HSP90AB1, FoxO3。 在蛋白水平,利用 Western Blot 验证 PKM2, STAT6, FoxO3,HSP90AB1基因在U87细胞中的表达,我们的研究发现PKM2, HSP90AB1和STAT6基因在ALDH1A3-shRNA胶质瘤U87细胞中表达较空白对照和阴性对照组降低(p<0.01),FoxO3基因在在ALDH1A3-shRNA胶质瘤U87细胞中表达水平较空白对照和阴性对照组升高(p<0.01)。结论:本研究首次利用RNA-seq技术对ALDH1A3-shRNA胶质瘤U87细胞中的差异表达基因进行了全面分析,发现共有104个差异表达基因,包括33个表达一致上调的基因、71个表达一致下调的基因,主要富集到8条信号通路上,通过蛋白质互作网络分析显示PKM2,HSP90AB1,FoxO3,STAT6基因起重要作用,其在胶质瘤发生发展中的机制仍需进一步研究。