【摘 要】
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研究意义和目的:耳聋作为最常见的残疾性疾病,63%的耳聋人群被诊断为感音神经性聋。病因多与遗传、老化、药物、噪声、感染、环境等多种因素有关,众多因素中遗传因素约占60%,但耳蜗功能不可逆损伤是其核心问题。因此,寻找与耳蜗结构和功能相关的基因并研究其在听觉功能中的作用机制就有着重要意义。耳蜗作为一个感官器官,物质运输是其结构和功能的基础。本课题研究内容为利用Klc2基因敲除小鼠研究与调控胞质内物质运
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研究意义和目的:耳聋作为最常见的残疾性疾病,63%的耳聋人群被诊断为感音神经性聋。病因多与遗传、老化、药物、噪声、感染、环境等多种因素有关,众多因素中遗传因素约占60%,但耳蜗功能不可逆损伤是其核心问题。因此,寻找与耳蜗结构和功能相关的基因并研究其在听觉功能中的作用机制就有着重要意义。耳蜗作为一个感官器官,物质运输是其结构和功能的基础。本课题研究内容为利用Klc2基因敲除小鼠研究与调控胞质内物质运输有关的候选基因Klc2,在听觉系统的作用及分子机制。研究方法:在野生型小鼠耳蜗通过Western Blot、RT-PCR检测Klc2的时空表达情况;并利用Klc2基因敲除小鼠模型、通过耳蜗石蜡切片HE染色、构建含目的基因重组质粒转染HEI-OC1细胞,构建内耳重组腺病毒相关病毒感染活体耳蜗实验观察KLC2在耳蜗和细胞的表达定位;通过听性脑干反应测试、基底膜铺片对毛细胞相关结构免疫荧光染色、扫描电子显微镜,观察Klc2基因敲除小鼠听觉功能和结构的变化;通过对Klc2基因敲除小鼠耳蜗组织样品免疫共沉淀质谱分析与KLC2潜在的交互蛋白,分析Klc2对听觉系统的影响机制。研究结果:1、野生型小鼠各组织Western Blot检测结果显示KLC2蛋白在大、小脑和耳蜗相对其他组织表达量高,野生型小鼠耳蜗发育各时间段RT-PCR检测结果显示P14Klc2转录量最高,且各Klcs在耳蜗发育过程转录量的趋势不一致,经敲除鼠验证,Klc2基因敲除鼠耳蜗内其他Klcs转录量并未出现增多或者减少的改变。Western Blot实验和RT-PCR实验分别在蛋白水平和m RNA水平验证Klc2相应表达产物的敲除;2、细胞实验显示重组质粒转染后在HEI-OC1胞质弥散分布,重组腺病毒相关病毒感染后,HA-标记在外毛细胞胞质表达,耳蜗石蜡切片HE染色观察到基因敲除小鼠的成鼠耳蜗毛细胞缺失;3、Klc2基因敲除小鼠成鼠出现明显听力损失和耳蜗外毛细胞缺失的情况,而P8的Klc2基因敲除小鼠静纤毛和动纤毛形态大致正常;4、经免疫共沉淀质谱分析本课题筛选出了MYO6、MYH14、SPTB1、SPTA1、ACTN2等潜在KLC2的互作蛋白。研究结论:1.KLC2蛋白在耳蜗相对其他组织表达具有组织特异性,并在胞质内发挥作用。2.本课题基本明确了Klc2基因全敲除小鼠致聋的表型,即自P14渐出现顶中圈外毛细胞明显缺失,且逐渐发展为全频重度耳聋,而底圈外毛细胞缺失相对顶中圈不明显,外毛细胞缺失程度与ABR听力损失程度不一致,提示外毛细胞缺失不是引起听力损失的唯一原因。3.本课题初步确定了Klc2不影响P8小鼠动静纤毛的形态结构,而且KLC2在胞质内的功能与微管形成无关。免疫共沉淀质谱分析得出耳蜗内可能与KLC2相互作用的蛋白,发现KLC2可能与一些明确与耳聋有关蛋白相互作用,相互作用的机制尚不能与表型联系,有待进一步验证。
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