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水仙病毒病给世界水仙的产量和品质带来了严重危害,造成了巨大损失,并且广泛分布于世界各个水仙栽培区。据报道,能自然侵染水仙的病毒大约有30种,其中分离报道的20多种病毒主要分布于线虫传多面体病毒属(Nepovirus)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)和香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)中。感病水仙主要感染的病毒种类为水仙黄条病毒(Narcissus yellow stripe virus,NYSV)和水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus,NMV),所分别表现的症状为花叶和黄条。目前,防治水仙病毒病的主要方法为培育脱毒植株,而准确的病毒检测技术是获得优良脱毒植株的关键。本研究通过田间病害调查,发现福建漳州和平潭水仙的田间发病植株症状表现类型多种多样,主要症状表现为叶片斑驳、色泽退绿变黄、出现条状病斑等。症状严重的水仙植株,叶片呈现块状病斑,有穿孔或裂痕,花的颜色杂乱,呈现出碎色。在电镜下可以观察到线状的病毒粒体,长度大约为550-850nm。结合生物学方法测定,通过利用设计的水仙病毒的特异性引物进行RT-PCR检测,检出的漳州和平潭水仙病毒主要有NMV、NYSV、水仙迟季黄化病毒(Narcissuslate seasonyellows virus,NLSYV)、水仙退化病毒(Narcissu degeneration virus,NDV)和水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus,NLV)。要达到准确鉴定水仙病害的目的,需要灵敏快速的检测方法作保证。本研究依据NMV、NDV和NYSV的保守基因序列,设计了 3对病毒特异性引物。提取水仙样本总RNA后,以总RNA为模板,利用3对特异性引物分别进行RT-PCR扩增,获得3条DNA片段,将获得的片段连接、转化、克隆后进行序列测定,测序结果核苷酸同源性达到98%以上,表明所获得的DNA片段为病毒的目的基因片段。通过单一 RT-PCR,分别建立了 NMV、NDV、NYSV的常规RT-PCR检测技术。在单一 RT-PCR检测的基础上,摸索和优化了能同时检测NDV、NYSV和NMV的三重RT-PCR检测技术体系。在反应体系方面,对Mg2+浓度、cDNA模板浓度、Taq DNA聚合酶浓度进行了优化;在反应条件方面,对退火温度和循环次数进行了优化,在一个体系中成功地获得了 751bp、623bp和483bp3条大小与试验设计相符合的条带,结果的可靠性通过序列同源性分析得到了验证,从而成功地建立了同时检测NYSV,NDV和NMV的三重RT-PCR检测技术体系。为探明我国福建漳州和平潭水仙病毒病的病原种类,本研究利用RT-PCR检测方法对采集于福建漳州和平潭的表现典型水仙病毒病症状的35份水仙样品进行了检测,共检测出了 NLSYV、NLV、NYSV、NDV、NMV5种病毒。漳州水仙的样本中检出率最高的为NDV,其次是NMV;平潭的样本中检出率最高的两种病毒分别是NYSV和NMV。其中,检出率最高的为NDV,达到77.14%;NMV和NYSV检出率分别是65.71%,和22.86%;NLSYV总检出率为45.70%,NLV的检出率为2.86%,为最低。复合侵染的比例高达77.14%,可见多种病毒混合侵染现象普遍发生。从“漳州水仙”、“平潭水仙”样品中分别克隆了 NYSV 6的CP基因、NDV Y9的Nia-Pro基因和NMVX1的CP基因,对克隆的NYSV、NDV、NMV的基因片段进行序列测定和分析,结果如下:①NYSV6 CP基因片段大小为751bp。该序列与GenBank上已报道的漳州NYSV-zhangzhou(EU430294.1)CP基因核苷酸序列有4个碱基的差异,相似性为99%。②NDVY9 Nia-Pro基因组片断大小为623bp。该序列与GenBank上已报道的Marijiniup 2(JQ395041.1)完整基因组序列有8个碱基的差异,相似性为99%。③NMV X1的CP基因片断大小为483bp。该序列与GenBank上已报道的新西兰NMV strain(AY225449.1)完整基因序列有10个碱基的差异,相似性为98%。该体系能对田间样品NMV、NDV、NYSV实现同步检测,极大的节省了实验所需的试剂和检测时间,降低了检测成本,提高了检测效率。