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猪传染性胸膜肺炎(ine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的高度接触性、致死性呼吸道疾病。研究表明,与病原菌毒力相关的因子很多,包括毒素、荚膜多糖、外膜蛋白、脂多糖等,其中毒素既是主要的毒力因子,也是主要的免疫原。APP可产生4种毒素,其中Apx Ⅱ除血清型10外,其余血清型都能分泌此毒素；所有血清型的APP都能分泌ApxⅣ, ApxⅣ只有在APP感染宿主时才产生,而在体外培养条件下不表达。一、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ-ELISA反应条件的优化及试剂盒的研制重组蛋白Apx Ⅱ表达和纯化经过改进,即在37℃,用0.8mM IPTG诱导4h；对早期建立的检测猪胸膜肺炎放线杆菌抗体的ApxⅡ-ELISA检测方法的反应条件进行优化,确定了最佳反应条件,抗原最适包被浓度为2.23μg/mL,包被时间为37℃1h后4℃过夜,封闭液为1%BSA/PBST,在37℃封闭lh。酶标二抗最适稀释浓度为1：20000。在此基础上研制成试剂盒,对其敏感性、特异性、重复性及稳定性进行测试。该试剂盒的批内和批间变异系数分别为2.52%～7.41%和2.96%-7.16%。与IHA试剂盒进行比较,符合率为86.7%。结果表明该试剂盒具有良好的特异性和敏感性,可快速准确的检测猪传染性胸膜肺炎。二、猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA试剂盒的研制重组ApxⅣ蛋白表达和纯化经过改进,即在30℃,用0.6mM IPTG诱导6h；在早期建立的猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA抗体检测方法的基础上,本研究对抗原酶标板制备工艺,酶标二抗、阴阳性血清和试剂盒的保存条件进行了测试,并组装成试剂盒。该试剂盒的批内和批间的变异系数分别为2.65%-8.40%和2.69%-11.3%；试剂盒置于-20℃至少保存9个月,4℃保存3个月。与科前ApxⅣ-ELISA检测试剂盒比较,两者的符合率为67.5%。该试剂盒能区分野毒感染和疫苗免疫猪产生的抗体。三、ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒的应用利用研制的ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA试剂盒检测了不同日龄猪血清样品和大量临床血清样品。发现在同一批猪不同日龄采集的血清中,两种毒素抗体阳性率均呈现先降后升的趋势,用ApxⅡ-ELISA试剂盒检测时,50-60日龄猪抗体阳性率降到最低,而用ApxⅣ-ELISA检测时,90-110日龄猪抗体阳性率达到最低水平。ApxⅡ-ELISA试剂盒检出了临床样品阳性血清288份,阳性率为34.3%；ApxⅣ-ELISA试剂盒检出了阳性血清191份,阳性率为22.8%。