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研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis)是由于动脉血管系统中易感区域内富含胆固醇、载脂蛋白B的脂蛋白在血管壁内滞留而引起的不适应性炎症反应。众所周知,巨噬细胞在动脉粥样硬化发生发展的进程中起着非常重要的作用。线粒体醛脱氢酶2(ALDH2)因其强大的代谢乙醇的能力而受到人们的广泛关注,它是参与乙醛,4-HNE和丙二醛(MDA)降解为乙酸的关键酶。近年来,众多的研究报道了 ALDH2活性激活之后减轻动脉粥样硬化的作用。ALDH2可以通过直接调节斑块细胞功能、改善代谢和介导炎症反应来影响动脉粥样硬化病变的发展。近期研究发现,在ApoE基因敲除的自发性动脉粥样硬化小鼠模型中,斑块面积,稳定性以及全身的促炎反应与巨噬细胞的氧化应激水平和DNA损伤有关。而cGAS-STING信号通路是巨噬细胞中参与DNA损伤应答的重要信号通路。而Kim等人发现在ALDH2基因缺失的小鼠肝脏组织中乙醇介导DNA损伤明显加重。尽管已经进行了许多研究来评估ALDH2对于动脉粥样硬化性疾病的各种机制,但是ALDH2在动脉粥样硬化的过程中对巨噬细胞的炎症反应的调节机制尚不清楚。根据以上所述,我们提出以下假说:ALDH2通过减轻巨噬细胞氧化应激造成的DNA氧化损伤进而抑制cGAS-STING信号通路激活,减轻巨噬细胞炎症反应。研究目的1.研究ALDH2对巨噬细胞DNA损伤的影响。2.探讨ALDH2对巨噬细胞炎症反应的影响及其机制。研究方法1.ALDH2对巨噬细胞cGAS-STING信号通路的影响1.1 ALDH2活性改变对顺铂或氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)介导的RAW264.7细胞中cGAS-STING信号通路的影响分别使用ALDH2激动剂Alda-1(20 μM),抑制剂Daidzin(60 μM)和等容的DMSO预孵育RAW 264.7细胞30分钟后,加入顺铂(16 μM),ox-LDL(80μg/mL)处理24小时,检测巨噬细胞cGAS-STING信号通路蛋白表达变化。1.2 ALDH2基因表达对顺铂或ox-LDL介导的腹腔原代巨噬细胞中cGAS-STING信号通路的影响分别提取ALDH2基因敲除和过表达小鼠以及野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞,加入顺铂(16μM),ox-LDL(80 μg/mL)处理24小时后,检测巨噬细胞cGAS-STING信号通路蛋白表达变化。2.ALDH2对RAW 264.7细胞炎症因子释放的影响分别使用ALDH2激动剂Alda-1(20 μM),抑制剂Daidzin(60 μM)和等容的DMSO预孵育RAW264.7细胞30分钟后,加入顺铂(16μM),ox-LDL(80μg/mL)处理24小时,检测细胞炎症因子的表达变化。3.STING对ALDH2调节巨噬细胞炎症因子释放的影响分别提取STING基因敲除小鼠和野生型小鼠的腹腔原代巨噬细胞使用Daidzin(60 μM)预孵育 30 分钟后,加入顺铂(16μM)或者 ox-LDL(80 μg/mL)处理24小时后,检测细胞中炎症因子的表达变化。4.ALDH2对顺铂或ox-LDL介导的巨噬细胞DNA损伤的影响4.1 ALDH2活性改变对顺铂或ox-LDL介导的RAW 264.7细胞中DNA损伤的影响分别使用ALDH2激动剂Alda-1(20 μM),抑制剂Daidzin(60 μM)和等容的DMSO预孵育RAW264.7细胞30分钟后,加入顺铂(16 μM),ox-LDL(80μg/mL)处理24小时,检测细胞中γ-H2A.X蛋白表达变化。4.2 ALDH2基因表达对顺铂或ox-LDL介导的腹腔原代巨噬细胞中DNA损伤的影响分别提取ALDH2基因敲除和过表达小鼠以及野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞,加入顺铂(16μM),ox-LDL(80 μg/mL)处理24小时后,检测巨噬细胞中γ-H2A.X蛋白表达变化。4.3 ALDH2对顺铂或ox-LDL介导的RAW 264.7细胞中DNA氧化加合物8-OHG的影响分别使用ALDH2激动剂Alda-1(20 μM),抑制剂Daidzin(60 μM)和等容的DMSO预孵育RAW264.7细胞30分钟后,加入顺铂(16 μM),ox-LDL(80μg/mL)处理24小时,分离提取细胞DNA纯化后,通过8-OHG检测试剂盒检测DNA中8-OHG含量变化。5.ALDH2活性改变对顺铂或ox-LDL介导的RAW 264.7细胞中氧化应激水平的影响分别使用ALDH2激动剂Alda-1(20 μM),抑制剂Daidzin(60 μM)和等容的DMSO预孵育RAW264.7细胞30分钟后,加入顺铂(16 μM),ox-LDL(80μg/mL)处理24小时,通过活性氧荧光探针和SOD试剂盒检测细胞ROS水平和SOD酶活性变化。6.ROS对ALDH2调节巨噬细胞炎症反应的影响6.1 ALDH2对H2O2介导的RAW 264.7细胞中cGAS-STING信号通路的影响分别使用Alda-1(20 μM)或Daidzin(60 μM)预孵育30分钟后,加入H2O2(20μM)处理24小时,检测细胞cGAS-STING信号通路蛋白表达变化以及炎症因子的转录变化。6.2 ROS对ALDH2调节RAW 264.7细胞炎症反应的影响分别使用N乙酰半胱氨酸(NAC,20 μM)或Daidzin(60 μM)以及二者共同预孵育RAW264.7细胞30分钟后,加入顺铂(16μM),ox-LDL(80μg/mL)处理24小时,分别检测巨噬细胞cGAS-STING信号通路蛋白表达变化,炎症因子的转录变化,DNA氧化损伤标志物8-OHG的变化。研究结果1.ALDH2对巨噬细胞cGAS-STING信号通路的影响1.1 ALDH2活性增强能够阻抑顺铂或者ox-LDL介导的RAW 264.7细胞中cGAS-STING信号通路的激活在RAW 264.7细胞系中,我们发现ALDH2活性增强能阻抑顺铂或者ox-LDL介导的cGAS-STING信号通中cGAS蛋白表达增加,STING,TBK1磷酸化增加。而ALDH2活性抑制则结果相反。1.2 ALDH2过表达能够阻抑顺铂或者ox-LDL介导腹腔原代巨噬细胞中cGAS-STING信号通路的激活在提取的小鼠原代腹腔巨噬细胞中,我们发现ALDH2过表达能阻抑顺铂或者ox-LDL介导的cGAS-STING信号通中cGAS蛋白表达增加,STING、TBK1磷酸化增加。而ALDH2基因敲除则结果相反。2.ALDH2减少RAW 264.7细胞炎症因子释放ALDH2的活性增强可以减少顺铂或者ox-LDL介导的RAW264.7细胞中IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α、Arg 分子 mRNA 转录水平升高,iNOS 的 mRNA转录水平下降,IL-1β、IFN-β释放增多,而ALDH2活性抑制剂Daidzin则是相反的结果。3.ALDH2调节巨噬细胞炎症因子释放是STING部分依赖的分别提取STING基因敲除小鼠和野生型小鼠的腹腔原代巨噬细胞使用Daidzin(60 μM)预孵育 30 分钟后,加入顺铂(16 μM)或者 ox-LDL(80 μg/mL)处理24小时后,我们发现ALDH2活性抑制后cGAS蛋白表达增加,TBK1磷酸化增加,以及下游炎症因子IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α转录水平升高,而这些变化在STING基因敲除的小鼠腹腔原代巨噬细胞中,除了 cGAS蛋白表达依然升高以外,均受到了部分程度阻抑。4.ALDH2减轻顺铂或ox-LDL介导的巨噬细胞DNA损伤4.1 ALDH2活性增强减轻顺铂或ox-LDL介导的RAW 264.7细胞中DNA损伤ALDH2的活性增强减少了顺铂或者ox-LDL介导的RAW 264.7细胞中γ-H2A.X蛋白表达,而ALDH2的抑制剂则会增加γ-H2A.X蛋白表达。4.2 ALDH2基因表达对顺铂或ox-LDL介导的腹腔原代巨噬细胞中DNA损伤的影响ALDH2基因过表达减少了顺铂或ox-LDL所介导的小鼠腹腔原代巨噬细胞中γ-H2A.X蛋白表达,而ALDH2基因敲除则会增加γ-H2A.X蛋白表达。4.3 ALDH2对顺铂或ox-LDL介导的RAW 264.7细胞中DNA氧化加合物8-OHG的影响ALDH2的活性增强减少了顺铂或者ox-LDL介导的RAW 264.7细胞DNA中氧化加合物8-OHG含量,而ALDH2的抑制剂则会增加8-OHG含量。5.ALDH2活性改变对顺铂或ox-LDL介导的RAW 264.7细胞中氧化应激水平的影响ALDH2的活性增强减少了顺铂或者ox-LDL介导的RAW264.7细胞中ROS的荧光强度,增强了 SOD酶的活性,而ALDH2抑制剂Daidzin则增强了 ROS荧光强度,降低SOD酶活性。6.ROS对ALDH2调节巨噬细胞炎症反应的影响6.1 ALDH2对H2O2介导的RAW 264.7细胞中cGAS-STING信号通路的影响ALDH2的活性增强可以减少H2O2介导的RAW264.7细胞中cGAS蛋白表达增加,STING、TBK1磷酸化增加,下游炎症因子IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA转录水平升高,IL-1β、IFN-β释放增多,而抑制ALDH2的活性则是相反的结果。6.2 ROS对ALDH2调节RAW 264.7细胞炎症反应的影响抑制ALDH2的活性能够增加顺铂或者ox-LDL介导的RAW264.7细胞中cGAS蛋白表达增加,STING、TBK1磷酸化增加,炎症因子,IFN-β、IL-1β,IL-6、TNF-α分子转录水平增加,IL-1β、IFN-β释放增多,DNA氧化加合物8-OHG增多,而使用ROS清除剂N乙酰半胱氨酸则可以阻抑上述结果。研究结论与意义1.首次发现ALDH2活性增强可以抑制cGAS-STING信号通路,减轻巨噬细胞炎症反应;2.揭示ALDH2可通过抑制氧化应激,减少巨噬细胞DNA氧化损伤,发挥抗cGAS-STING激活的作用;3.提示在ALDH2活性下降的患者中,cGAS-STING信号通路是减轻巨噬细胞炎症反应的重要靶点。