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以本研究实验室保存的壳聚糖酶产生菌-烟曲霉CK(Aspergillus fumigatus,CK)作为出发菌株,通过紫外线和微波进行复合诱变处理,利用抗分解代谢培养基,筛选出一株发生基因组正突变的菌株,起始菌株的壳聚糖酶活是13.68U/mL,正突变株后UW-17壳聚糖酶活高达22.43U/mL,是起始菌株的1.6倍,且遗传稳定性良好。
分离纯化烟曲霉的代谢产物-壳聚糖酶,通过比较有机溶剂沉淀法、盐析沉淀法、等电点沉淀法,确定利用等电点沉淀法结合有机溶剂沉淀法分离纯化壳聚糖酶,在保持溶液的pH为7.5,乙醇体积分数为60%的时候,壳聚糖酶的酶活收率为92.1%,分离纯化效果最好。
通过比较多种固定壳聚糖酶的方法,发现大部分固定化酶方法会出现酶活力回收率低、稳定性不强、酶活下降快等缺点,最终以聚乙烯醇(PVA)复合凝胶作为载体,利用反复冻融法固定化壳聚糖酶,经研究发现壳聚糖酶经过固定化以后,显著提高了其机械强度和化学稳定性,并且可以多次重复使用。通过单因素试验和中心组合设计响应面分析,确定了壳聚糖酶固定化的最佳条件:以10.88%聚乙烯醇(PVA)和1.07%海藻酸钠复合凝胶为载体,置入-20℃冰箱,反复冻融18h,得到的固定化酶效果最好。并对游离的壳聚糖酶和固定化的酶的特性进行比较,经固定化的酶,其机械性能和化学稳定性都得到显著提高,与游离酶相比,固定化酶的最适反应pH值由5.5降至5.0,最适反应温度是由60℃升至65℃,其米氏常数由7.24mg/ml升至10.12mg/ml,固定化的酶在连续使用7次,保持80%的酶活。并用固定化酶反应器(φ=15mm)制备壳寡糖,在径高比为1:10,添加固定化酶129,壳聚糖底物的流加速度为0.8mL/min时,固定化酶的酶促反应效率最快,为将来工业化应用打下基础。并通过薄层色谱法分析水解产物,可以将不同聚合的壳寡糖很好的分开,并对其平均聚合度和相对分子量的进行测量,壳寡糖的平均聚合度为3,平均分子量为501。