克里米亚刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV）的传染性高、致命性强。从ICTV的分类中得知,CCHFV隶属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）、内罗病毒科（Nairoviridae）、正内罗病毒属（Orthonairovirus）[1]。该病毒会引起一种急性的传染病——克里米亚刚果出血热（Crimean-Congo hemorrhagic fever,CCHF）,非洲、东欧、中东等地此病流行较为广泛,是一种以蜱为媒介的自然疫源性疾病[2]。该病临床上以发热、胃肠道出血、呕血、低血压、休克为主要特征,病死率高,可达3-30%[3]。1965年,此病在我国新疆的巴蜀地区第一次被发现,所以在我国又称之为新疆出血热（Xinjiang hemorrhagic fever,XHF）[4]。除此之外,该病抗体在我国安徽、青海、四川等区域内被发现,表明我国境内该病可能不仅限于新疆地区[4]。同时,在全球范围内,该病涉及到的地区中,有许多国家属于我国倡导的“丝绸之路经济带”沿线国家,随着全球经济一体化和国际交流的日益频繁,旅游、贸易以及境外维,我国也时刻面临着输入性CCHF的威胁,因此其防治任务十分艰巨。目前,针对CCHFV的预防和治疗还没有特异性的疫苗和药物。在疫苗研发方面,主要包括传统疫苗——灭活疫苗以及新型疫苗的开发[5]。在药物使用方面,目前用于CCHF临床治疗的药物主要为广谱性药物,如利巴韦林等,一般的支持性治疗也无法特异且有力的发挥最佳疗效。造成如此境况的一个重要原因是因为CCHFV安全等级较高,要求BSL-4级生物安全条件下才可进行活病毒研究,但全球大多数实验室不具备高等级生物安全条件。因此本论文想通过实验技术手段寻找一个安全可靠的替代者,将其视作“病毒”进行疫苗研发和药物筛选等相关研究。这个替代者就是具有入胞及转录翻译能力的病毒样颗粒（transcription and entry-competent virus-like particle,tecVLP）。tecVLP由病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）和病毒的微基因组组成。VLP不含病毒核酸,由病毒的结构蛋白自组装形成;微基因组中包括微基因组质粒和辅助质粒,前者将病毒基因替换为报告基因从而构建重组质粒,后者则是将结构蛋白基因插入到真核表达载体中构建重组质粒。当VLP与微基因组结合,形成的tecVLP与病毒颗粒形态结构相似,且病毒基因组被破坏,所以不具有自我复制的能力,安全性极高。同时,该tecVLP具有一次入胞以及转录翻译的能力。因此,本课题拟通过实验技术获得CCHFV tecVLP,以代替活病毒进行疫苗评价和药物筛选。在本研究中,通过p CAGGS载体分别构建了带有Nano Luc的微基因组质粒及能够表达L基因、M基因和S基因的辅助质粒,以及p CAGGS-T7。质粒构建并鉴定成功后,共转染微基因组质粒和辅助质粒,结果提示微基因组系统无误,且后续鉴定时应裂解细胞后进行检测。微基因组系统验证无误后,开始包装tecVLP,在前述四个质粒的基础上,加入表达包膜糖蛋白的重组质粒进行共转染。结果初步表明本实验应在转染后72h收集细胞内样品,鉴定时需预转辅助质粒,在感染48h后检测。在此基础上进行大量包装CCHFV tecVLP,浓缩并对其滴度进行测定。此外,本论文通过电镜观察到了tecVLP颗粒。用包装好的CCHFV tecVLP分别感染Huh7细胞和C57小鼠,通过荧光素酶试剂盒和Q-PCR的测定,均显示成功构建了CCHFV tecVLP细胞和动物感染模型,细胞成像也初步得到了良性结果。在此基础上,我们分别利用细胞平台和动物平台进行四种药物伊曲康唑、索拉菲尼、氯丙嗪、氯喹是否可以抑制tecVLP入胞以及转录翻译的评价。同时,本论文利用tecVLP分别检测了以CCHFV Gc、Gn、NP为抗原所制疫苗的中和效力。结果显示,通过以上平台,我们成功的筛选了能够抑制病毒入胞及转录翻译能力的药物,并评价了疫苗的中和抗体滴度及动物保护效果。本论文通过对CCHFV tecVLP的表达,及其在细胞及动物体内感染平台的建立,最终成功的应用于CCHFV疫苗评价及药物筛选。本研究将会为CCHFV疫苗研发及药物筛选的广泛开展奠定坚实的基础,并最终服务于CCHF的防控和治疗。