论文部分内容阅读
博卡病毒是近几年被发现的一种人、猪、牛、犬、猩猩等多种哺乳动物共患的新型DNA病毒。人类博卡病毒(human bocavirus,HBoV)是2005年最早发现的新型博卡病毒。有相关研究指出HBo V存在于黑猩猩、大猩猩等灵长类动物,与大猩猩博卡病毒有着极其高的同源性;此外,研究HBo V的免疫学特性有利于更好的理解和研究其他新兴的动物博卡病毒。人类博卡病毒1型(HBoV1)普遍存在幼儿体内,有可能会引起急性呼吸系统疾病。另外三种人类博卡病毒(HBoV2-4)的感染常发生于胃肠道,可能与婴幼儿腹泻或胃肠炎相关。世界各地均有在血清、呼吸道等样本中检测到博卡病毒的报道;但博卡病毒的致病机理还不清楚。当一些个体先后感染两种相似的毒株后,机体产生的是针对初始感染毒株的抗体,而不是目前感染毒株的抗体。这种具有抗原相似性的病毒在免疫应答上相互影响的现象,自1950年以来一直被称为“原始抗原效应”(original antigenic sin,OAS)。本研究采用3种不同的检测方法-荧光定量PCR(q PCR)、反转录PCR(RT-PCR)及MariPOC抗原检测系统-检测鼻咽腔分泌物样本中HBoV1的存在。在269份样本中,HBoV1 DNA在qPCR中的阳性率为8.1%(22/269),样品中的拷贝数在5.13E+01到7.23E+09copies/mL之间。RT-PCR阳性率为3.35%(9/269),MariPOC抗原检测系统阳性率为3.71%(10/269),两者检测到病毒对应的DNA的最小拷贝数约为107copies/mL。初步判定在呼吸道样本中HBoV1 DNA拷贝数大于107copies/mL时,病毒处于急性感染期。为了研究HBoV感染在人体内的相互作用,本研究针对从过百名儿童从出生起按照每3-6个月的间隔收集的近两千份血清进行了研究。在该人群中,HBoV1 DNA的检出率最高为24%;HBoV2-4DNA的检出率分别为6%、1%和1%。抗HBo V1 IgM的阳性率为32%,HBoV2 IgM的阳性率为10%,并未发现HBoV3 IgM的阳性样本。抗HBoV1-3 IgG中阳性率最高的为抗HBoV1 IgG(86.2%);抗HBoV2 IgG的阳性率为53.2%,抗HBoV3 IgG的阳性率为10.1%。上述结果均表明HBoV1的感染率最高,其次为HBoV2,HBoV3最差。上述血清样本中,发现在有一种以上HBoV的感染的儿童中,一些个体在感染第二种HBoV后,继发性的感染并不能导致特异性的抗体响应。因此认为HBoV1-4的感染存在原始抗原效应,本文对其进行后续研究。为了能够在可控条件下研究在人类血清中观测到的原始抗原效应,本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统,构建了HBoV4 VP2蛋白的病毒样粒子并大规模表达了HBoV1-4 VP2蛋白的病毒样粒子,同时优化了将用于测试原始抗原效应的检测方法。首先,成功构建了pAcUW51-HBoV4-VP2杆状病毒载体,进行体外鉴定无误后,提取重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,收获重组病毒并表达了目的蛋白。经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白在High5昆虫细胞中获得表达,蛋白大小为62kDa。Western blot检测结果表明表达的蛋白可与HBoV4阳性血清发生特异性反应,证实所表达的蛋白具有良好的抗原性。对裂解后的细胞上清进行了氯化铯密度梯度离心,PBS重悬后负染电镜观察,电镜下观察到22nm左右的类似HBoV4的球形粒子,进一步证实病毒样粒子构建成功。然后,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统大规模表达了HBoV1-4 VP2蛋白的病毒样粒子,并利用氯化铯超速离心纯化蛋白,SDS-PAGE显示其大小与预测一致,纯度良好。使用非阻断和阻断IgG ELISA,证明其抗原性良好。然后使用纯化后的HBoV4重组蛋白初步建立了HBoV4间接IgG ELISA方法。初步确定了临界值,当血清样品OD492nm≥0.243时,检测结果可判定为阳性,OD492nm<0.243时为阴性。对已有的10个HBoV4阳性样本进行检测,符合率为100%。在使用HBoV1-3抗原阻断交叉抗体后,使用HBoV4间接ELISA检测192份儿童血清样品,其阳性率为3.6%(7/192)。并针对兔源血清,对已有的HBoV1-4间接IgG ELISA方法进行了改良。改良后,兔源血清最佳稀释度为1:1000,阻断抗原最佳浓度为30mg/mL;猪抗兔IgG/HRP的最佳使用浓度为1:2000。随后,利用人类细小病毒B19(B19V)及上述HBoV1-4病毒样粒子,采用10组不同的组合方式免疫家兔。第一种HBoV或B19V抗原接种60天后,接种第二种HBoV或B19V抗原,并从接种前直到接种后120天期间定期收集血清。通过非阻断和异源阻断HBoV IgG ELISA对HBoV1-4 IgG抗体进行血清学分析,结果表明所有的兔子均表现出明显的抗体反应。B19V并不会与HBo V1产生原始抗原效应,同源抗原HBoV1和HBoV2加强免疫后,抗该抗原的IgG抗体水平并未明显增加。在异源HBoV的组合内有一半的兔子显示出了不同程度的原始抗原效应,这与本研究在人类血清学研究中的得到的结果一致。对上述表现为不同程度原始抗原效应实验动物进行了抗体动力学分析,并通过第三方HBoV IgG ELISA检测交叉反应抗体的变化水平。对于再次免疫抗原为HBo V1的实验动物,发生原始抗原效应几率较大(66%)。而对于再次免疫抗原为HBoV2的实验动物,发生原始抗原效应几率较小(25%)。博卡病毒是第一个展现出原始抗原效应现象的细小病毒。本研究结果为HBoV1-4免疫研究提供了新的方向,并证实了人类博卡病毒诊断学的复杂性。为未来HBoV血清学诊断和疫苗的研制提供了理论基础。