阿霉素(doxorubicin, Dox)又名多柔比星,属蒽醌类抗生素,是临床上最为常用的一种广谱高效的抗肿瘤药物,但其容易在心脏中特异性蓄积,从而诱发心脏毒性,导致严重的心肌损伤和心力衰竭,这严重限制了其临床应用。Dox心脏毒性机制的研究主要是其在代谢过程中产生了活性氧(Reactive oxygen species, ROS),过量的ROS攻击心肌细胞,从而引起心肌氧化损伤。有研究表明Dox可增加心肌细胞内ROS的产生,并且可使心肌细胞抗氧化物酶活性的降低,从而使心肌细胞处于氧化应激状态。金属硫蛋白(metallothionein, MT)是一类低分子量的富含半胱氨酸的金属结合蛋白,其广泛存在于哺乳动物的各种组织器官中。MT具有与重金属结合作用和对自由基的清除功能,在氧化应激状态下对外源性物质所引起的细胞组织损伤具有一定的保护作用,因此MT被认为是一种内源性细胞保护物质。我们前期研究发现,金属硫蛋白在对抗Dox心脏毒性过程中发挥了重要作用,但具体作用机制仍然不是十分清楚。JAK-STAT (Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)代表的是一条极其快速的从细胞外到细胞核的信号转导通路。JAK (Janus Activated Kinase)是非受体型酪氨酸激酶,有4个成员,包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。其中JAK1、JAK2和TYK2在各种细胞中普遍表达,而JAK3主要在造血细胞中表达。AG490是JAK2的特异性拮抗剂,是一种PTK抑制物,它可作为JAK-STAT信号通路的特异性抑制剂。STAT (signal transducers and activators of transcription)为信号转录因子及活化子,可被JAK磷酸化而活化。在哺乳动物细胞中,STATs家族可以分为七个亚型,STAT1、STAT2、 STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。JAK-STAT信号通路是细胞因子信号转导的重要途径,涉及细胞增殖分化、凋亡、免疫、炎症、肿瘤和心肌损伤等多种病理生理过程。我们前期工作发现,无论是生理状态下还是Dox作用前后,MT野生型(MT+/+)小鼠和MT-Ⅰ/Ⅱ型基因敲除(MT-/-)小鼠的心脏组织中,JAK-STAT信号通路上的基因表达均有变化,提示JAK-STAT信号转导通路与MT抗Dox所致的心肌细胞氧化损伤作用有关。因此,本实验主要是阐明JAK-STAT信号通路在MT抗Dox心肌毒性中的作用。采用原代培养的MT野生型(MT+/+)小鼠和MT基因敲除(MT-/-)小鼠乳鼠的心肌细胞进行体外实验,细胞给予Dox处理后,采用western blotting方法检测Dox作用前后,MT+/+和MT-/-乳鼠的心肌细胞中JAK2和STAT3蛋白以及二者磷酸化蛋白表达情况。结果表明,Dox给药后,MT+/+小鼠心肌细胞中JAK2和STAT3蛋白的磷酸化水平均明显升高,提示MT对抗Dox心肌毒性的作用可能是通过JAK-STAT信号转导通路发挥的。为了进一步研究JAK-STAT信号转导通路是否真正的参与了MT抗Dox心肌毒性的过程,我们用JAK-STAT信号转导通路的特异性抑制剂AG490对心肌细胞进行预处理。实验分为四组即：对照组,AG490单独给药组,Dox染毒组,AG490预处理后Dox染毒组。通过观察心肌细胞形态学的变化,测量心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出量以及Hoechst33258染色法测心肌细胞凋亡情况来反映心肌细胞受损情况。结果发现,采用AG490预处理以后可增加MT+/+小鼠的心肌细胞的凋亡数并加重Dox对MT+/+小鼠的心肌细胞毒性,但对MT-/-小鼠并没有太大影响。大量研究表明Dox的心脏毒性主要与ROS的大量生成有关,细胞内产生的过量的ROS能攻击脂质、蛋白质以及DNA等生物大分子,从而造成心肌细胞的氧化损伤。本实验通过对心肌细胞内ROS含量、心肌细胞脂质过氧化程度、蛋白质羰基化程度以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力的检测,来反映心肌细胞的氧化损伤及抗氧化状态,以此来评价MT对Dox所致心肌细胞氧化应激的作用。结果发现,AG490可加重Dox对MT+/+小鼠心肌细胞的氧化损伤,并降低MT+/+小鼠心肌细胞的氧化防御能力。综上所述,阻断JAK-STAT信号通路,降低MT+/+小鼠心肌细胞的抗氧化能力,并加重Dox对其氧化损伤作用,而对MT-/-小鼠则没有明显的影响。因此本实验表明,MT抗Dox心肌毒性的部分作用是通过激活JAK-STAT信号通路而发挥的。