研究背景骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是以骨量降低和骨微结构破坏而导致骨脆性增加和易于发生骨折为特征的一种全身性代谢性骨病。目前随着社会老龄化趋势的日益加重,骨质疏松症成为了重要的公共健康问题,其严重影响着人们的生活质量。而随着我国社会发展的不断进步,我国的骨质疏松症患者越来越多,目前已居于世界首位,且骨质疏松症的发病率仍在逐年上升,因此我国人口老龄化程度也在不断加深。预计到2015年,我国60岁以上老年人口将达到2.16亿,占全国总人口的16.7%。而目前我国60岁以上女性骨质疏松的患病率达53.5%,男性为12.1%。而因骨质疏松症导致骨折等并发症所引起的致残、致死造成治疗上耗资较大,因此骨质疏松会给患者、家庭和社会均带来沉重的负担。所以,骨质疏松症的防治已成为世界性的公共卫生问题之一,并亟需解决。雷奈酸锶(strontium ranelate, Sr)是一类能够显著地降低绝经后妇女椎体和非椎体骨折风险的新型抗骨质疏松药物。研究认为雷奈酸锶通过多种机制促进骨形成,例如,增强前成骨细胞和成骨细胞的复制能力及功能活动,包括促使骨基质合成增多、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性增高以及上调成骨细胞相关基因,如Runt-相关转录因子2(Runt-related transcription factor-2, Runx2)、ALP和骨钙素(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins,BGP)等,其中,Runx2是成骨细胞分化的关键转录因子,激活后启动成骨细胞分化,其特异性地表达于成骨细胞上。而成骨细胞是由骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)定向分化生成,因此,BMSCs向成骨细胞分化在骨形成中必不可少。Peng S等发现雷奈酸锶可以通过调控丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路,特别是通过激活其中的细胞外信号调节激酶1/2(extracellular-signalregulated kinase1/2, ERK1/2)与p38MAPK通路及Runx2的表达促使BMSCs向成骨细胞分化。我们的前期实验证明,转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2, BMP2)和骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7, BMP7)在雷奈酸锶促进BMSCs成骨分化中起重要作用。Hedgehog (Hh)家族是一组分泌性的信号蛋白。在哺乳动物中,Hedgehog信号有3个同源基因：Sonic Hedgehog (Shh)、Indian Hedgehog (Ihh)和Desert Hedgehog (Dhh),分别编码Shh, Ihh和Dhh蛋白。研究显示,Hedgehog信号分子对脊椎动物骨骼系统的形成和发育具有重要的调节作用。而Shh和Ihh信号分子尤为重要,它们在肢体发育的过程中起着关键调控作用。但在雷奈酸锶促进BMSCs向成骨细胞分化的过程中,Hedgehog信号通路是否参与并如何起作用,国内外的相关研究尚未完全明了。为此,本实验研究了Shh和Ihh在雷奈酸锶促进BMSCs向成骨细胞分化的过程中所起的作用,以在细胞分子水平上进一步阐明雷奈酸锶促进骨形成的作用机制。研究方法1、大鼠BMSCs的分离及培养取1只4周龄的SD大鼠,采用颈椎脱臼法处死大鼠后将其浸泡在75%的乙醇中消毒5min,取出放置在预先经紫外线消毒过的超净台上,在无菌条件下剪开大鼠的皮肤、肌肉,分离出两侧的股骨和胫骨,将骨周围的肌肉和筋膜等组织尽量剔除干净,小心剪去股骨近端及胫骨远端使骨髓腔暴露,用DMEM/F12完全培养基反复冲洗骨髓腔,收集含细胞的培养基至15mL的无菌离心管中,1000rpm离心5min,离心后弃去上清液,在离心管中再加入5mL的DMEM/F12完全培养基重悬细胞,然后将细胞悬液接种至25cm2的培养瓶中,放置于37℃、含5%C02的培养箱中进行培养。24h后待细胞贴壁行首次换液,以后每隔2-3d换液1次,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态及细胞形态,直至细胞生长达80%～90%融合时进行1：2传代纯化。2、BMSCs的成骨分化待BMSCs传代至第3-5代时,将细胞种植于培养皿或者培养板中,待细胞生长达80%～90%以上融合后根据不同实验组的要求加入含不同雷奈酸锶药物浓度、10%胎牛血清、1×10-8mo1/L地塞米松、1Ommol/L β-甘油磷酸钠和5Omg/L抗坏血酸的由DMEM/F12培养液配制而成的成骨诱导液进行培养。3、ALP活性检测待BMSCs传代培养至第3代时,将其接种于24孔板中,根据不同实验组要求给予相应的处理,培养细胞7d后收集细胞,首先加入0.2%的Triton X-100裂解细胞,裂解后用PBS洗2遍,然后在离心机上12000rpm离心10min左右,取上清液按照碱性磷酸酶试剂盒的说明书进行操作。此处采用酶标法检测ALP活性。在酶标仪520nm波长下进行细胞ALP活性的测定。4、茜素红钙结节染色待细胞传代培养至第3代时,将细胞接种于6孔板中(板中预先放置24mm×24mm盖玻片)。根据不同实验组要求给予相应的处理,在第21天时收集细胞,按照茜素红钙染色试剂盒的说明书进行操作。依次予样本固着、染色和澄清处理,随后在倒置显微镜下观察钙结节的染色情况并进行计数。计数时每组选3个样本,每个样本随机选1个视野(×100),计数后开始统计各组间的差异。5、Western blotting法检测Shh、Ihh和Runx2蛋白的表达待BMSCs传代培养至第3代时,将细胞接种在60mm的培养皿中,各实验组给予不同的浓度或时间处理因素后,开始操作。弃去细胞原培养液,用预冷的PBS洗2遍,将皿中剩余的PBS吸干,然后在皿中加入适量细胞裂解液,放置在4℃冰箱进行裂解30min,裂解完成后收集细胞,于12000rpm离心10min,弃去上清,采用BCA蛋白定量试剂盒开始进行蛋白定量。经SDS-PAGE分离总蛋白后,将蛋白转移至PVDF膜上。进行封闭(5%的脱脂奶粉1.5h),随后开始敷抗体,分别加入Ihh抗体(1：10000)、Shh抗体(1：100)、Runx2抗体(1：500),4℃过夜,然后用TBST将膜洗3遍,每遍5min,随后敷羊抗兔二抗(Ihh膜：1：2500,Shh膜：1：4000,Runx2膜：1：2500)慢孵90min,再用TBST将膜洗3遍,每遍5min。取出膜,暗室中用ECL发光试剂进行显色,曝光,最后采用凝胶成像系统扫描,进行统计分析。6、统计学处理数据经SPSS13.0统计学软件进行统计学分析,结果均以均数±标准差(mean±S)来表示,组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、Sr对BMSCs Shh表达的影响不同浓度Sr(0.1、1、3、5mmol/L)处理BMSCs7d后,与对照组相比,Sr组BMSCs的Shh表达量均显著高于对照组(P<0.01),且在1mmol/L Sr时Shh表达水平达最高值；在浓度为3和5mmol/L时,Shh表达量较1]mmol/L浓度时有所减少,但仍高于对照组,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。但在10mmol/L Sr浓度组,细胞内Shh表达水平显著低于对照组(P<0.01)。应用1mmol/L Sr作用BMSCs1d、3d、5d、7d后,与对照组相比,Sr呈时间依赖性(0-7d)地显著提高细胞内Shh的表达(P<0.01)；作用14d时,细胞内Shh虽然较7d时有所降低,但仍显著高于对照组(P<0.01)。2、Sr对BMSCs Ihh表达的影响不同浓度Sr (0.1、1、10mmol/L)处理BMSCs7d后,与对照组相比,各Sr组BMSCs内Ihh表达量均与对照组无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。而且对照组和各Sr组中细胞内的Ihh蛋白表达水平几乎保持不变。3、Sr对BMCSs Runx2表达的影响不同浓度Sr(0.1、1、3、5、10mmol/L)处理BMSCs7d后,与对照组相比,在0.1、1、3、5mmol/L的Sr组,细胞内Runx2表达量均显著高于对照组(P<0.01),且在3mmol/L Sr时Runx2的表达量最多；但10mmol/L Sr组细胞内Runx2表达水平显著低于对照组(P<0.01)。选用3mmol/L Sr分别培养BMSCs3d、5d、7d后,与对照组相比,在3-7d时间范围内,BMSCs的Runx2表达量呈时间依赖性地增加(P<0.01);3mmol/L Sr作用14d时,Runx2的表达水平显著低于对照组(P<0.01)；1d组Runx2的表达水平与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。4、Hh特异性阻断剂Cy抑制Sr对BMSCs Shh的上调作用1mmol/L Sr作用于BMSCs7d, Shh的表达量较对照组有明显的增加,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。当同时应用10μmol/L Cy和1mmol/LSr共同作用BMSCs7d时,与Sr组相比,Shh表达量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)；10μmol/L Cy本身对Shh的基础表达无明显影响。5、Hh特异性阻断剂Cy抑制Sr对BMSCs Runx2的上调作用3mmol/L Sr作用BMSCs7d,与对照组相比,Runx2表达量较对照组有明显增多,差异具有统计学意义(P<0.01)；当10μmol/L Cy和3mmol/L Sr同时作用BMSCs7d,可使Runx2表达显著地减小,与Sr组比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。10μmol/L Cy本身对Runx2的基础表达无明显影响。6、Hh特异性阻断剂Cy对BMSCs Ihh表达的影响1mmol/L Sr作用BMSCs7d时,与对照组相比,Ihh表达无明显改变,无统计学意义(P>0.05)；10μmol/L Cy与1mmol/L Sr同时作用BMSCs7d时,与Sr组相比较,Ihh表达也无明显改变,无统计学差异(P>0.05)。10μmolfL Cy本身对Ihh的基础表达无影响。7、Sr及Hh特异性阻断剂Cy对BMSCs ALP活性和钙结节的影响3mmol/L Sr作用BMSCs7d时,ALP活性显著高于对照组(P<0.01)；但是,当Hh特异性阻断剂Cy (10μmol/L)与Sr共同作用BMSCs7d却使ALP活性显著低于Sr组(P<0.01)。另方面,Sr(3mmol/L)作用BMSCs21d使钙结节形成显著高于对照组(P<0.01),Hh特异性阻断剂Cy (10μmol/L)和Sr (3mmol/L)共同作用BMSCs21d后,Cy明显抑制Sr对钙结节形成的促进作用,与Sr组比较,其钙结节数量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。10μmol/L Cy本身对ALP活性或钙结节形成无明显地影响。结论1、雷奈酸锶可以通过增加BMSCs的ALP活性、钙结节数量和Runx2的表达来促进其向成骨细胞的分化。2、Shh信号分子介导雷奈酸锶促进BMSCs分化为成骨细胞的作用。3、Ihh信号分子可能不参与体外雷奈酸锶促使BMSCs定向向成骨细胞分化的这个过程。这表现在,雷奈酸锶及Hh特异性阻断剂剂Cy对Ihh蛋白的表达量无明显影响。