目的:糖尿病是威胁人类健康的重要疾病。目前,移植胰岛治疗糖尿病已初见疗效,但由于胰岛来源匮乏和免疫排斥反应而受阻。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源广泛,取材简单,在体外易于分离、培养和纯化,且具有多向分化的潜能,是进行细胞移植的理想种子细胞。然而MSCs向胰岛细胞的诱导分化阳性比率低、分化细胞的胰岛素分泌功能差等不足成为制约目前分化方案的主要障碍。神经元限制性沉默因子(neuronal restrictive silencing factor,NRSF),在胚胎干细胞及成体细胞中均有表达,但在成熟的神经元和胰岛细胞中却没有表达。因此提示NRSF在干细胞的干性维持及胰腺发育可能发挥着重要的作用。研究发现干涉NRSF后的MSCs,经过胰高血糖素GLP-1及bFGF等细胞生长因子的辅助诱导下,分化为胰岛样细胞的效率明显增加。在本实验中,我们通过RNA干涉技术,下调MSCs内源NRSF表达,并分析干涉NRSF后MSCs向胰岛样细胞分化的能力。　　 方法:　　 无菌条件下,自正常成人骨髓分离单个核细胞,采用密度梯度离心和贴壁消化传代的方法行体外扩增纯化,经流式细胞术鉴定表型、脂肪样细胞方向诱导分化鉴定分化潜能,获取合格MSCs;采用NRSF慢病毒干涉载体包装人胚肾293FT细胞,收集含有病毒颗粒的培养上清,转染MSCs,倒置荧光显微镜下观察转染效率,建立稳定干涉内源性NRSF的MSCs(MSCs-siNRSF);参照杨印祥等报道的方法,定向诱导MSCs-siNRSF胰岛样细胞方向分化,双硫腙染色鉴定胰岛细胞形成,RT-PCR法检测胰岛素基因表达。　　 结果:　　 1.MSCs的形态学鉴定采用密度梯度离心和贴壁消化传代的方法,自正常人骨髓获取的细胞呈现典型的MSCs生长形态。　　 2.MSCs的表型鉴定流式细胞检测结果显示,密度梯度离心和贴壁消化传代的细胞高表达间质细胞标志CD44、CD90,不表达造血干细胞及成熟造血细胞标志CD3、CD49d。提示分离获取的细胞具有MSCs表性特征。　　 3.MSCs的分化潜能鉴定经定向诱导分化后,密度梯度离心和贴壁消化传代的细胞胞质中可出现大小不一的脂滴,油红染色后脂滴为红色。提示分离获取的细胞具有脂肪样细胞分化潜能。　　 4.MSCs-siNRSF的构建倒置荧光显微镜下观察,携带绿色荧光蛋白慢病毒载体转染后的MSCs,可见稳定的绿色荧光信号。提示MSCs-siNRSF构建成功。　　 5.MSCs-siNRSF胰岛样细胞的定向诱导分化经胰岛样细胞定向诱导分化后,MSCs-siNRSF逐渐变圆,并聚集成团;RT-PCR结果显示胰岛素基因表达;双硫腙染色阳性。提示MSCs-siNRSF可成功诱导分化为胰岛样细胞。　　 结论:　　 1.采用密度梯度离心与贴壁消化传代法,可获得合格的MSCs。　　 2.所分离的MSCs具有干细胞形态及分化潜能。　　 3.成功地构建MSCs-siNRSF,进一步检测有助于MSCs体外分化为胰岛素样细胞。