论文部分内容阅读
目的采用百草枯建立HL-1心肌细胞衰老模型,观察睾酮对心肌细胞衰老的影响,并探讨局部作用的胰岛素样生长因子1(Locally acting Insulin‐like Growth Factor-1 isoform,mIGF-1)/沉默信息调节因子2相关酶1(Silent mating type Information Regulation 2 homolog1,SIRT1)通路在睾酮对心肌细胞衰老影响过程中的作用。方法(1)预实验确定百草枯对心肌细胞衰老影响的最佳作用时间、筛选睾酮干预的最佳浓度。通过β-半乳糖苷酶染色法测定细胞衰老率、流式法测定细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平进行细胞衰老检测。(2)观察睾酮对mIGF-1、SIRT1蛋白表达的影响:采用Western blotting法检测正常细胞(CK)组、百草枯诱导(PQ)组、百草枯+睾酮干预(Tes)组mIGF-1、SIRT1的表达水平,采用细胞免疫荧光染色法检测SIRT1在细胞核中的定位。(3)探究mIGF-1在睾酮延缓心肌细胞衰老中的作用及其与SIRT1表达的相关性:预先构建mIGF-1过表达载体及沉默载体并转染心肌细胞,经百草枯+睾酮处理后,分为以下5组:mIGF-1过表达转染(OE-m IGF-1)组、空载转染(NC)组、mIGF-1干扰转染(sh-mIGF-1)组、阴性对照转染(sh-NC)组、空白对照(Tes)组,观察mIGF-1对睾酮处理的心肌细胞衰老效应变化的影响及干扰mIGF-1对SIRT1表达的影响。(4)进一步确定SIRT1在睾酮延缓心肌细胞衰老中的作用:预先构建SIRT1过表达载体及沉默载体并转染心肌细胞,经百草枯+睾酮处理后,分为以下5组:SIRT1过表达转染(OE-SIRT1)组、空载转染(NC)组、SIRT1干扰转染(sh-SIRT1)组、阴性对照转染(sh-NC)组、空白对照(Tes)组,观察SIRT1对睾酮处理的心肌细胞衰老效应变化的影响。(5)qPCR法检测各组细胞收缩/舒张相关酶及蛋白表达变化,进一步观察睾酮、mIGF-1/SIRT1通路激活对衰老心肌细胞伴随的功能影响。结果(1)与CK组相比,100μmol/L百草枯使心肌细胞衰老率增加,以作用时间为72h时差异具有统计学意义(P<0.01)。与PQ组相比,Tes组可呈剂量依赖性地降低百草枯诱导的细胞衰老率及细胞内的ROS水平,以1.0μM浓度时差异最为显著(P﹤0.001)。(2)与PQ组相比,Tes组能增加m IGF-1和SIRT1蛋白表达(P﹤0.01)及SIRT1在细胞核中的定位水平(P﹤0.05)。(3)与Tes组相比,OE-mIGF-1组mIGF-1、SIRT1蛋白表达及SIRT1在细胞核中的定位水平增加(分别为P﹤0.05、P﹤0.01、P﹤0.05),细胞衰老率、ROS水平降低(P﹤0.05)。与Tes组相比,sh-mIGF-1组可下调mIGF-1、SIRT1蛋白表达及SIRT1在细胞核中的定位水平,增加细胞衰老率和ROS水平(P﹤0.05)。与Tes组相比,sh-NC组、NC组上述指标均无统计学差异(P>0.05)。(4)与Tes组相比,OE-SIRT1组SIRT1蛋白表达及SIRT1在细胞核中的定位水平增加(分别为P﹤0.05、P﹤0.01),细胞衰老率、ROS水平降低(P﹤0.05)。与Tes组相比,sh-SIRT1组可下调SIRT1蛋白表达及SIRT1在核中的定位水平,增加细胞衰老率与ROS水平(P﹤0.01)。与Tes组相比,sh-NC组、NC组上述指标均无统计学差异(P>0.05)。(5)与CK组相比,PQ组心肌细胞MYH-7及ACTA-1 mRNAs表达水平增加,MYH-6及SERCA-2 mRNAs表达水平降低(P﹤0.01)。与PQ组相比,Tes组心肌细胞MYH-7及ACTA-1 mRNAs表达降低,MYH-6及SERCA-2 mRNAs表达增加(分别为P﹤0.01、P﹤0.001、P﹤0.01、P﹤0.01)。与Tes组相比,sh-mIGF-1、sh-SIRT1组MYH-7及ACTA-1 mRNAs表达水平升高,MYH-6及SERCA-2 mRNAs表达下降(P﹤0.05);双敲低时(sh-double组,即sh-“mIGF-1 and SIRT1”)呈现出相同趋势,MYH-7及ACTA-1 mRNAs表达水平升高(分别为P﹤0.01、P﹤0.05),MYH-6及SERCA-2 mRNAs表达下降(分别为P﹤0.01、P﹤0.05)。与Tes组相比,OE-mIGF-1组MYH-6 mRNA水平升高(P﹤0.05),OE-SIRT1组MYH-6 mRNA和SERCA-2 mRNA水平升高(分别为P﹤0.05、P﹤0.01),而两组中MYH-7及ACTA-1 mRNAs表达水平均未见明显差异(P>0.05)。结论睾酮能延缓百草枯诱导的HL-1心肌细胞衰老,其抗衰老的机制与mIGF-1/SIRT1通路的激活有关。