论文部分内容阅读
研究背景与目的:人类免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球性问题,由于HIV和HCV的感染途径相类似,都可以通过输血、静脉吸毒、性接触、母婴等途径传播,所以HIV和HCV合并感染在临床中非常普遍,在我国HIV阳性人群合并HCV抗体阳性的感染率约59%。自高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)开展普及以来,HIV感染者和艾滋病患者的生存质量和寿命现已得到显著提高,但是由于合并HCV感染而引起的肝脏功能损害已成为HIV感染者及艾滋病患者发病和死亡的重要原因。针对基因1型感染者使用干扰素联合利巴韦林方案治疗持续病毒学应答率(SVR)低的问题,有研究者近年研发了一系列HCV蛋白酶抑制剂,其疗效虽然已得到肯定,但也有报道指出其耐药的发生,甚至可由于氨基酸突变而出现的原发耐药。本研究第一部分以广州市第八人民医院感染科门诊治疗的HIV/HCV合并感染人群为研究对象,对其HCV RNA进行提取及测序分型,以了解目前广东省HIV/HCV合并感染人群的分子流行病学情况;第二部分通过对研究对象的NS3 SP区测序,分析其序列氨基酸的突变情况,阐明我省患者是否天然存在相对优势的NS3的耐药变异株。研究方法:第一部分采用荧光定量PCR技术对广州市第八人民医院感染科HIV/HCV合并感染患者进行HCV RNA检测,选取病毒载量大于1000 IU/ml的412例患者入组,提取其保留血浆中的HCV RNA,逆转录成c DNA后,根据目的序列位置,使用相应引物扩增出CORE区及NS5B区序列,通过HCV序列数据库的HCV.blast及构建分子进化树去确定HCV基因型。第二部分根据已确定的基因分型,对412例样本c DNA进行NS3SP区特异性扩增,根据不同的基因型设计使用相应的反应引物,把所得到的NS3区序列利用Bio Edit软件进行对齐修饰。将修饰后序列上传至Geno2pheno[hcv]耐药检测分析模块进行耐药位点突变分析,以及利用Bio Edit软件进行翻译,与国外文献报道的耐药突变位点进行比对确定有无发生耐药位点突变。研究结果:第一部分1、近年来广东省合并感染人群中通过静脉吸毒途径感染的人群所占比重逐渐下降,而通过异性接触传播感染的比重有上升趋势,同性接触传播及输血传播比重均维持在较低的水平。2、广东省合并感染人群存在1a、1b、2a、3a、3b、6a、6n共7个亚型,其中以6a型(53.35%)为主,其次为1b型(17.86%),近年来3型所占比例有逐步上升趋势,1a及6n型在我省处于低流行状态。3、基因型与传播途径有密切关系,在静脉吸毒感染途径中以6a型感染为主,异性传播中6a型和1b型分别为主、次要流行亚型,输血传播则以1b型为主。4、基因型具有地域分布聚集性,HCV 6a型主要在珠三角、粤北地区、粤西地区中流行(44-57%),1b型则是粤东地区的主要流行亚型(54%),3型在各地区间均处于第三流行亚型(8-17%)。第二部分1、扩增成功的样本中,有349例(90.18%)检测一个或多个变异位点,共700个。检出主要变异位点D168E有3例(0.78%),A156G有1例(0.26%);R155I有1例(0.20%),次要变异I132V有37例(9.56%);T54S有4例(1.03%),197例Q80K(50.1%)以及1例Q80R(0.3%)。不同基因型在同一位点上的突变频率不同。2、通过Geno2pheno[hcv]耐药检测分析模块对NS3 SP区序列进行分析检测,本研究中发现T54S、Q80K、Q80R、I132V、R155I、A156G、D168E共7个已明确对药物作用有影响的耐药突变位点。I132V位点对药物作用影响最轻,仅可能对Telaprevir产生耐药;而Q80R位点对药物作用影响最严重,对Boceprevir、Simeprevir、Faldaprevir均可产生耐药性;T54S、Q80K、R155I和A156G分别对两种不同药物可产生耐药性,而D1681E仅对Simeprevir一种药物可产生耐药性。结论:1、广东省HIV/HCV合并感染人群HCV基因亚型分布与感染途径和地域分布有密切关系,粤东部分以1b型为主,传播途径主要为血液;粤西及珠三角以6a型为主,以静脉吸毒传播为主。2、广东省HIV/HCV合并感染人群中对NS3/4A SP蛋白酶抑制剂存在原发耐药突变,突变位点在不同HCV基因型发生率不同,使用NS3/4A SP蛋白酶抑制剂前,因行基因型检出及原发耐药检测。3、第一代NS3/4A SP蛋白酶抑制剂对于1b、3型患者因T54、R155、A156位点可能存在原发突变,使用前应先行原发耐药突变检测;第二代蛋白酶抑制剂Simeprevir因Q80位点突变率高,或致原发耐药,在6a型患者上使用宜慎重。