目的:疟疾是一种由疟原虫引起的,经按蚊叮咬而传播的严重危害人类健康的感染性疾病,2020年全球约有2.41亿疟疾病例和62.7万疟疾死亡病例。脑疟（CM）等严重的并发症是造成患者死亡的主要原因。中草药的有效成分对疟疾等疾病的治疗作用已被医学界广泛研究。虎杖苷（polydatin;3,4,5-trihydroxystilbene-3-β-d-glucoside;transresveratrol 3-β-mono-D-glucoside;piceid）是一种天然活性成分,主要来源于传统中药虎杖。现代医学研究发现,虎杖苷具有抗炎、抗氧化和诱导肿瘤细胞凋亡等多种生物和药理作用。白藜芦醇作为虎杖苷的苷元,在植物中主要以虎杖苷形式存在。虎杖苷可在肝药酶、肠道菌群的作用下在肠道被迅速转化为白藜芦醇,发挥生物学作用。最近研究发现,白藜芦醇（Resveratrol）能够增强铁螯合剂对疟原虫的杀伤作用,改善伯氏疟原虫感染小鼠的贫血和肝损伤。蛋白对接研究表明,白藜芦醇抑制疟原虫SHLP蛋白,阻断疟原虫的传播,可以作为一种潜在的药物设计配体。体外研究发现,虎杖苷和白藜芦醇对恶性疟原虫均具有抗疟活性,并且虎杖苷IC50小于白藜芦醇。摄入虎杖苷和白藜芦醇后,血清中的代谢产物主要以虎杖苷为主,提示虎杖苷口服吸收率和代谢稳定性高于白藜芦醇。目前,虎杖苷对疟疾的免疫作用尚未见报道,其抑制炎症反应的免疫调控机制也未完全阐明。因此,本研究通过建立Pb A感染小鼠模型,探讨虎杖苷对实验性脑疟（ECM）的影响及其免疫机制。研究方法:1.实验动物模型构建及药物处理。将小鼠随机分为未感染组（对照组）、Pb A感染组（Pb A组）、低剂量虎杖苷给药组（Pb A+Polydatin25组）和高剂量虎杖苷给药组（Pb A+Polydatin50组）。Pb A感染组和虎杖苷给药组小鼠腹腔注射1×10~6个Pb A寄生的红细胞引起感染。虎杖苷给药组小鼠从感染前一天开始腹腔注射25mg/kg/d或50 mg/kg/d溶于1%DMSO的虎杖苷,连续注射6天。对照组和Pb A感染组小鼠给与同等剂量1%DMSO。2.计数红细胞感染率以及生存率。通过光镜下观察姬姆萨染色薄血涂片来检测寄生虫血症,每天监测死亡率。3.BBB完整性评价。实验小鼠分为未感染组（对照组）、Pb A感染组（Pb A组）和虎杖苷给药组（Pb A+Polydatin组）,感染后第6天静脉注射2%依文思蓝溶液200μL评价BBB完整性。4.脑组织病理。每组选取3只小鼠制备脑组织切片,苏木素伊红（HE）染色检测血管内皮细胞损伤情况。5.细胞体外培养。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和小鼠树突状细胞DC2.4分别培养于含有10%FBS、100 U/m L的链霉素及100 U/m L青霉素的高糖DMEM培养基中,取对数生长期细胞用于后续实验。6.MTS细胞活力检测。将巨噬细胞RAW264.7或树突状细胞DC2.4接种于96孔板上,实验分为对照组、DMSO组和虎杖苷组。对照组仅加入DMEM完全培养基,虎杖苷组分别加入3.125μM、6.25μM、25μM、50μM或100μM的虎杖苷,DMSO组加入同等剂量的DMSO。培养48小时后,采用MTS细胞增殖试剂盒检测。7.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）活性检测。取感染第5天Pb A感染组和虎杖苷给药组脾细胞提取总蛋白,根据制造商的说明使用G6PD分析比色试剂盒进行检测。8.活性氧（ROS）检测。采用中国碧云天公司活性氧检测试剂盒按照说明书的方法,采用流式细胞仪检测各组脾脏细胞中ROS的荧光强度。9.制备脾细胞悬液。C57BL/6小鼠感染后第3、5天,无菌取出各组小鼠脾脏,研磨法制备脾细胞悬液。培养48小时后,收集脾细胞培养上清。10.制备腹腔巨噬细胞悬液。C57BL/6小鼠感染后第5天,收集腹腔巨噬细胞。将细胞浓度调整为1×10~6个/m L,接种细胞到24孔板内,48小时后收集细胞培养上清液。11.一氧化氮（NO）检测。将100μM Na NO2等倍稀释加入96孔板。将0.1 m L各组培养上清液加到96孔板中并加入0.1 m L Griess试剂混匀,室温避光孵育10分钟,使用酶标仪在550 nm处读取吸光度。12.荧光抗体染色及流式细胞术分析。制备各组小鼠脾脏细胞悬液,运用流式细胞术检测树突状细胞（DCs）（CD11c+）、CD80（+）DCs（CD80+CD11c+）、CD86（+）DCs（CD86+CD11c+）、MHCⅡ（+）DCs（MHCⅡ+CD11c+）、骨髓源性抑制细胞（MDSCs）（CD11b+Gr-1+）、单核细胞MDSCs（M-MDSCs）(CD11b+Gr-1+Ly6ChighLy6G-)、粒细胞MDSCs（PMN-MDSCs）(CD11b+Gr-1+Ly6ClowLy6G+)、Th1（CD4+IFN-γ+T-bet+）、PD-1（+）Th1（CD4+IFN-γ+T-bet+PD-1+）、CTLA4（+）Th1（CD4+IFN-γ+T-bet+CTLA4+）、Th17（CD4+RORγt+IL-17+）和调节性T细胞（Treg）（CD4+CD25+Foxp3+）、PD-1（+）Treg（CD4+CD25+Foxp3+PD-1+）、TIM3（+）Treg（CD4+CD25+Foxp3+TIM3+）的分化情况及TLR4和TLR9的表达情况。巨噬细胞RAW264.7荧光抗体染色及流式细胞仪分析:将巨噬细胞RAW264.7分为对照组、LPS组、给药组（LPS+Polydatin）。培养24小时后收集各组细胞悬液（1×10~7）1 m L,检测M1型巨噬细胞（CD11b+F4-80+CD86+）和M2型巨噬细胞（CD11b+F4-80+CD206+）的分化情况。树突状细胞DC2.4荧光抗体染色及流式细胞仪分析:树突状细胞DC2.4分组处理方法同上述RAW264.7细胞,检测MHCⅡ在CD11c+DCs的表达情况。13.细胞因子检测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）测定试剂盒检测脾细胞培养上清中细胞因子TNF-a、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β和IL-17的分泌水平。检测腹腔巨噬细胞培养上清中细胞因子TNF-a、IL-1β和IL-6的分泌水平。检测RAW264.7巨噬细胞培养上清中细胞因子TNF-a、IL-1β、IL-6和IL-10的分泌水平。14.Western blot检测。在细胞中加入磷酸酶抑制剂和RIPA裂解液提取总蛋白。采用bicinchoninic acid（BCA）蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。采用western blot方法检测各组脾细胞和巨噬细胞RAW264.7中NLRP3、caspase1和NF-κB p65蛋白的表达。15.统计分析。所有数据采用平均值±标准误差（SEM）的方法表示,两组之间比较使用student’s t检验,多组之间比较使用One-way ANOVA。生存率分析使用Log rank（mantel cox）检验。采用SPSS17.0统计软件分析数据,p＜0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.虎杖苷提高Pb A感染C57BL/6小鼠生存率。低剂量虎杖苷给药组显著延长了感染小鼠的生存率。感染后第10天,低剂量虎杖苷给药组小鼠存活率为57.14%,无脑疟相关神经症状,而Pb A感染组小鼠存活率仅为14.28%。高剂量虎杖苷给药组小鼠生存率与感染组无显著性差异。虎杖苷给药组小鼠呈现低虫血症,但与感染组比较,各组之间差异均没有统计学意义。因此,我们选择低剂量（25mg/kg/d）虎杖苷用于后续实验。2.虎杖苷保护BBB,减轻ECM病理损伤。与对照组相比,Pb A感染组BBB破坏明显,大脑呈现深蓝色,而虎杖苷给药组小鼠的大脑颜色更浅,小鼠大脑的OD630测量值比Pb A感染组低约50%。HE染色结果发现Pb A感染后小鼠大脑血管被白细胞浸润明显,而虎杖苷处理后白细胞浸润血管数显著降低。3.虎杖苷抑制Th1细胞的分化,降低Th1细胞免疫检查点CTLA4的表达,减少IFN-γ的表达。Pb A感染后第5天,脾脏中Th1细胞的百分比和绝对数均显著升高,脾细胞培养上清液中IFN-γ的表达水平明显高于对照组,Th1细胞免疫检查点PD-1和CTLA4的表达均明显升高。虎杖苷处理后脾脏中Th1细胞所占百分比和绝对数均明显减少,IFN-γ的表达水平显著降低,Th1细胞CTLA4的表达低于感染组。4.虎杖苷抑制Th17细胞的分化,减少IL-17的表达。Pb A感染后第3天,各组小鼠Th17细胞在脾脏中所占百分比无显著改变,而Th17细胞的绝对数在感染组显著高于对照组。Pb A感染后第5天,脾脏中Th17细胞的百分比和绝对数均显著升高,脾细胞培养上清液中IL-17的表达水平显著升高。虎杖苷处理明显降低Th17在脾脏中所占的百分比和数量,降低IL-17的表达水平。5.虎杖苷促进Treg细胞的分化,增加Treg细胞PD-1的表达,增加TGF-β和IL-10的表达。研究发现,在感染后第3和第5天,Treg细胞在脾中的百分比和绝对数明显增加,虎杖苷给药组可以促进CD4+T细胞向Treg细胞分化,但与Pb A感染组间Treg细胞的绝对数差异无统计学意义。感染第5天,Pb A感染组脾细胞培养上清液中抗炎症因子TGF-β和IL-10的表达水平明显升高,而虎杖苷给药组TGF-β和IL-10的表达水平显著高于感染组。Pb A感染后Treg细胞PD-1和TIM3的表达均明显升高,其中虎杖苷给药组Treg细胞上PD-1的表达高于感染组。6.虎杖苷抑制树突状细胞分化和成熟,降低树突状细胞TLR4和TLR9的表达。在感染后第3天,与对照组比较,DCs及CD80+、CD86+、MHCⅡ+DCs在感染组脾细胞中的绝对数和百分比均出现明显的升高。虎杖苷给药后,DCs及CD80+、CD86+、MHCⅡ+DCs在脾中的绝对数明显低于感染组。感染后第5天,与Pb A感染组比较,虎杖苷给药组DCs和CD86+DCs在脾细胞中的绝对数显著下降,而DCs上CD80和MHCⅡ的表达没有差异。感染后,TLR4和TLR9的表达显著高于未感染组,虎杖苷给药后TLR4和TLR9的表达下降。检测不同浓度虎杖苷处理48小时对DC2.4细胞活力的影响。结果显示,与对照组或DMSO组比较,给药后48小时各浓度虎杖苷对DC2.4细胞活力影响的差异无显著性,提示在3.125μM～100μM浓度范围内虎杖苷对DC2.4细胞没有毒性损伤。流式细胞术检测结果发现,与对照组比较,LPS组MHCⅡ的表达明显升高,而虎杖苷给药组MHCⅡ的表达显著降低。7.虎杖苷降低巨噬细胞TLR4和TLR9的表达,抑制巨噬细胞炎症反应。感染组巨噬细胞TLR4和TLR9表达显著高于未感染组,虎杖苷给药后TLR4和TLR9的表达明显下降。感染后第5天,虎杖苷处理能够降低感染引起的脾细胞培养上清液中TNF-α和IL-6的表达升高,降低腹腔巨噬细胞培养上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平。MTS试验结果显示,虎杖苷刺激48小时后各虎杖苷给药组与对照组或DMSO组比较,对RAW264.7巨噬细胞活力的影响差异均没有统计学意义,提示在3.125μM～100μM浓度范围内虎杖苷对RAW264.7细胞没有毒性损伤。采用ELISA方法检测细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10在RAW264.7细胞培养上清液中的表达水平。和对照组比较,LPS组TNF-α、IL-6和IL-10的表达水平显著升高,而虎杖苷处理可以降低TNF-α和IL-6的表达水平。IL-10的表达水平在虎杖苷处理后出现上升趋势但差异不具有统计学意义。采用流式细胞术检测各组RAW264.7细胞培养24小时之后细胞表型的改变。结果显示,LPS处理后巨噬细胞中M1/M2比率升高,而虎杖苷处理能够抑制巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化,降低M1/M2比。8.虎杖苷抑制NF-κB和NLRP3炎症小体信号通路的激活。结果显示,感染第5天,NF-κB、NLRP3和caspase1蛋白在Pb A感染小鼠中表达显著上调,小鼠脾细胞培养上清液中IL-1β的表达水平显著升高。虎杖苷给药处理的感染小鼠中NF-κB、NLRP3和caspase1蛋白下调,IL-1β的水平明显降低。我们进一步验证虎杖苷对RAW264.7细胞炎症通路的作用。结果显示,虎杖苷给药处理能够抑制LPS对NF-κB、NLRP3和caspase1蛋白的刺激作用,降低RAW264.7巨噬细胞IL-1β的分泌水平。9.虎杖苷增加Pb A感染小鼠脾脏中MDSCs的数量,促进PMN-MDSCs的分化。Pb A感染后第5天,与对照组相比,脾细胞中MDSCs及其亚型的数量明显增加,虎杖苷处理后可以上调感染小鼠脾细胞中MDSCs和PMN-MDSCs在脾细胞中的绝对数而脾细胞中M-MDSCs的绝对数量的差异没有统计学意义。10.虎杖苷抑制G6PD酶活性引起活性氧累积,降低一氧化氮的水平。结果发现,与感染组比较,虎杖苷给药组脾细胞的G6PD活性显著降低。Pb A感染抑制了脾细胞中ROS的生成,NO水平均显著升高,而虎杖苷诱导脾细胞中ROS升高,NO水平明显下调。结论:1、虎杖苷处理改善实验性脑疟症状,提高小鼠生存率。2、虎杖苷处理可以增强Treg细胞介导的免疫抑制作用。3、虎杖苷处理减少Pb A感染的C57BL/6小鼠DCs的分化和活化,抑制TLR4和TLR9的表达,对NF-κB/NLRP3炎症小体通路发挥负向调控作用。4、虎杖苷处理促进Pb A感染的C57BL/6小鼠PMN-MDSCs的分化。5、虎杖苷处理抑制G6PD酶活性,引起ROS累积,降低NO水平,降低感染引起的病理反应。