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一、背景与目的在肿瘤发生发展过程中,核转录因子κB(NF-κB)的活化起着重要作用。已知NF-κB活化与肿瘤形成、血管生成、远处转移、抗凋亡等关系密切,而在肿瘤耐药方面,目前的研究资料认为NF-κB活化后可上调肿瘤细胞存活基因的转录,使肿瘤细胞逃避化疗药物所引起的死亡效应,从而诱导肿瘤耐药。在过去的研究中,已揭示了细胞表面受体诱导NF-κB活化的过程:在未受到刺激的细胞中,NF-κB与抑制蛋白结合在一起主要存在于细胞浆中。受到某些因子的刺激后,细胞浆内的一系列激酶活化从而引起NF-κB的活化,随即,活化的NF-κB进入细胞核,激活目的基因的转录。但最近的研究资料表明,NF-κB活化的“胞核至胞浆(nuclear-to-plasmic)”通路也许更为重要,因为大多数化疗药物可直接引起DNA损伤,其诱导NF-κB活化的始动因素正是居于细胞核内。PIDD(p53-induced protein with a death domain)在细胞DNA损伤中介导了NF-κB“胞核至胞浆”通路的活化过程。它是最近发现的一个蛋白分子,主要存在于胞浆内,分子量约100kDa,在胞浆中分裂成为含死亡结构域的C末端PIDD-C和富含亮氨酸重复序列的N末端PIDD-N。目前的研究发现PIDD-C可进入胞核内与NEMO (NF-κB essential modulator)和RIP1 (receptor-interacting protein 1)形成“胞核PIDD复合体”,在基因毒性应激(genotoxic stress)条件下,SUMO(small ubiquitin-like modifier)与复合物中的NEMO(NF-κB essential modulator)结合,促进其发生磷酸化和泛素化,活化后的NEMO从胞核进入胞浆,降解IκB, NF-κB即被活化进入胞核,启动存活基因的转录,从而表现为抗凋亡效应。鉴于PIDD在细胞抗凋亡的过程中起着重要作用,而既往有关研究资料又缺乏对PIDD与结肠癌细胞药物敏感性关系的探讨,本研究重点讨论PIDD所介导的抗凋亡途径与HT-29细胞药物敏感性变化的关系,初步明确PIDD对于结肠癌细胞药物敏感性的作用,以进一步完善结肠癌细胞耐药性的发生机制。二、方法1. PIDD siRNA的构建、转染及检测根据人PIDD的mRNA,应用RNAi设计软件,进行全基因组扫描和序列同源性分析,设计针对Genbank中PIDD的特异siRNA四对,同时设计一套序列相同的阴性对照。将siRNA分别转染HT-29细胞,转染24h、48h、72h用荧光显微镜检测转染效率。提取细胞蛋白,并用Western blot法检测转染效果。选择转染效果最佳的siRNA作为转染组,进行后继实验。2.分别用5-Fu处理空白对照组、阴性对照组及转染组的细胞,抽提处理前后共6组细胞的胞浆及胞核蛋白,Western blotting检测PIDD表达。3组细胞处理前后NF-κB活性及凋亡率的变化分别由凝胶阻滞分析实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)及流式细胞仪(FCM)检测。MTT法检测3组细胞对5-Fu的敏感性。三、主要结果1. PIDD siRNA的转染效率荧光显微镜观察,各组转染细胞组在各时相点的转染率均大于90%,Western blotting检测,可以发现与其它3种siRNA相比较,PIDD-360的转染效率有升高的趋势,但差异无统计学意义。同时这种抑制效应存在一定的时效关系,即:转染48h后能检测出抑制效应,72-96h左右达到最高峰。2. Western blotting结果提示转染组的细胞核和细胞质中,PIDD的表达均明显低于对照组;在空白组对照组和阴性对照组细胞中PIDD主要分布于细胞质,细胞核少见表达。空白对照和对阴性照给予5-Fu处理后PIDD分布发生了明显的变化,迁移至细胞核中;转染组5-Fu处理后PIDD在胞浆和胞核中的表达仍未升高。3. MTT结果显示转染组的药物敏感性明显降低,与空白对照组及阴性对照组相比有统计学意义(P<0.05)。4. EMSA检测细胞核蛋白NF-κB的活性未用5-Fu处理的3组HT-29细胞NF-κB的表达均为阴性,在用5-Fu刺激后,空白对照组及阴性对照组NF-κB的活性明显增高,而转染组则仍为阴性。5. FCM分析三组细胞的凋亡率接近,无统计学差异(P>0.05),但给予5-Fu处理后,则转染组的凋亡率大大高于其他两组,差异显著(P<0.05)。四、结论1.特异性siRNA可减低HT-29细胞中PIDD-C的表达,其抑制效应较为明显,且存在一定的时效关系。2. PIDD-C形成的胞核复合体能有效激活HT-29细胞中无活性的NF-κB,启动存活基因的转录,从而诱导了抗凋亡途径的激活,使HT-29细胞对于5-Fu的药物敏感性下降。3.干扰HT-29细胞PIDD-C的表达能有效降低胞核PIDD复合体的形成,使NF-κB活性降低,从而抑制抗凋亡途径,HT-29细胞对5-Fu的药物敏感性升高。