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类风湿性关节炎是一种慢性多关节炎症疾病，主要表现为滑膜炎症，最终导致骨和软骨的损伤。目前针对类风湿性关节炎的治疗方法很多，如手术疗法、药物疗法、免疫疗法和基因疗法等，但是这些疗法并不完美，仍需探索新的疗法和策略。为此，本研究首先探讨了通过引入外源基因来打破自身免疫耐受的新型基因疗法对类风湿性关节炎的治疗作用。鉴于T淋巴细胞是类风湿性关节炎的主要效应细胞，而骨损伤是类风湿性关节炎致残的主要原因，故本研究进一步探讨了T淋巴细胞在骨损伤中的作用及机制。
鉴于TNF-α在类风湿性关节炎中的重要作用，本研究选择其作为治疗靶基因。首先比较了小鼠与人以及其他几种哺乳动物TNF-α基因的同源性，根据同源性特点决定用人TNF-α基因作为异源基因。接着用RT-PCR从PMA活化的Jurkat细胞中扩增出人全长TNF-α基因序列，然后用TA克隆的方法将其连接入分泌型和非分泌型哺乳动物细胞表达质粒载体，这两种载体分别为pSecTag和pTARGE，最后将质粒载体转入细菌，挑出阳性克隆，用PCR筛选接入方向正确的克隆，测序验证阅读框架正确，获得装有目的基因的载体，分别命名为pSecTag-TNF-α和pTARGE-TNF-α。将分泌表达TNF-α基因的质粒和表达不相关抗原PSA(前列腺特异性抗原)的对照质粒pSecTag-PSA分别瞬时转染B16和Jurkat细胞，结果在转染了pSecTag-TNF-α的细胞细胞培养上清中能检测到TNF-α的活性。上述结果表明载体构建成功。
接着考察上述载体对类风湿性关节炎的动物模型胶原关节炎小鼠的治疗作用，结果发现用pSecTag-TNF-α和pTARGE-TNF-α提前免疫小鼠四周，能显著抑制鸡Ⅱ型胶原免疫两次所致的小鼠足肿胀、脾肿大和炎症细胞浸润，且分泌型载体效果略优于非分泌型，而空载体pTARGE和pSecTag-PSA无此作用。分离上述小鼠的脾和淋巴结细胞，用CFSE标记后培养48小时，再用流式细胞仪检测其增殖，或培养48小时后用JC-1染色，再用流式细胞仪检测其凋亡，结果发现正常小鼠脾细胞的自发凋亡明显，而增殖较少，模型组与之相比，有明显的自发增殖，而自发凋亡显著减少，用pSecTag-TNF-α和pTARGE-TNF-α提前免疫的小鼠脾细胞的自发凋亡较模型小鼠显著增加，脾细胞的自发增殖与模型小鼠相比明显减少，用pSecTag-PSA和pTARGE提前免疫的小鼠的脾细胞自发凋亡与增殖与模型组相似。用RT-PCR的方法检测来自上述小鼠脾细胞中的细胞因子和转录因子，结果发现与正常组相比，模型组小鼠脾细胞中的Th1细胞因子TNF-α和IFN-γ表达量增加，Th1转录因子T-bet表达亦增加。用pSecTag-TNF-α和pTARGE-TNF-α载体治疗可以抑制IFN-γ和T-bet的表达，但对TNF-α的表达无影响，pTARGE和pSecTag-PSA治疗组与模型组类似。用ELISA法检测上述小鼠血清中的TNF-α水平。与正常组相比，模型组小鼠血清中的TNF-α显著增加。用pSecTag-TNF-α和pTARGE-TNF-α治疗能显著抑制TNF-α的增加，而pSecTag-PSA和pTARGE则无此效果。用Westernblottiog检测小鼠血清中抗TNF-α抗体的产生，结果发现仅pSecTag-TNF-α和pTARGE-TNF-α治疗组小鼠的血清中既有抗人TNF-α的抗体，又有抗小鼠TNF-α的抗体，而其他组小鼠中未检测到抗TNF-α的抗体。用Westernblotting法检测上述小鼠脾细胞中抽提出来的蛋白质的磷酸化水平，发现治疗组和非治疗组之间酪氨酸磷酸化水平明显不同。上述结果表明，表达人TNF-α的载体对胶原性关节炎有治疗作用，其机理是打破机体对TNF-α的免疫耐受，从而使机体产生针对TNF-α的抗体，中和了过量的TNF-α，从而抑制了其他Th1细胞因子，转录因子的表达并且影响了磷酸化网络。
骨损伤是类风湿性关节炎的一个重要特征，严重时会导致残疾。但是对于骨损伤的机理，目前的研究还不是很多，尤其是T淋巴细胞在其中的作用。因此我们进一步研究T淋巴细胞是否直接参与骨损伤。首先在昆明种小鼠上用鸡Ⅱ型胶原成功诱导了关节炎模型，与正常小鼠相比，模型小鼠有明显的足肿胀，足肿胀的时间曲线也具有关节炎的特征。用生物活性法检测小鼠血清中的IFN-γ和TNF-α活性，发现模型小鼠中这些Th1细胞因子的活性较正常小鼠高。用RT-PCR的方法检测小鼠脾细胞中的细胞因子、转录因子以及Fas，发现与正常小鼠相比，模型组小鼠脾细胞中IFN-γ，TNF-α，T-bet和Fas的表达增加。将正常小鼠的脾细胞，模型小鼠的脾细胞或用PMA活化的正常小鼠的脾细胞与骨细胞共同培养，发现模型小鼠的脾细胞或用PMA活化的正常小鼠的脾细胞对骨细胞有毒性作用，而正常小鼠的脾细胞则无此作用。检测上述三种脾细胞培养上清中的MMP-9活性和NO含量，发现与正常小鼠相比，模型小鼠脾细胞上清中的MMP-9含量和NO含量均增加，而正常小鼠的脾细胞用PMA处理过后培养上清中的MMP-9含量增加而NO含量未见变化。用不同浓度的鸡Ⅱ型胶原与脾细胞共培养发现仅模型小鼠的脾细胞对鸡Ⅱ型胶原产生增殖反应。通过检测关节部位的MMP-9，NO，IFN-γ和TNF-α含量，发现与正常小鼠相比，关节炎小鼠的组织中含有更多的TNF-α，IFN-γ和MMP-9，但是NO的含量二者相同。在体外培养的脾细胞中加入TNF-α，IFN-γ或TNF-α+IFN-γ，发现TNF-α，IFN-γ单独分别能够提高MMP-9的活性，并具有协同作用。因此我们认为在关节部位产生的TNF-α和IFN-γ能上调免疫细胞产生的MMP-9活性，并且导致了骨损伤。