1-磷酸鞘氨醇抑制哮喘小鼠炎症作用的机制研究

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目的:探讨1-磷酸鞘氨醇受体2(S1P2)拮抗剂JTE-013对卵清白蛋白(OVA)诱导的小鼠哮喘炎症的作用及其机制。方法:取40只健康BALB/C小鼠分为四组:分别为正常组,模型组,JTE-013治疗组和RAC1抑制剂组。正常组(CON组)于第0,7,14天腹腔注射生理盐水(NS),200ul/只;第21天起,取10ml生理盐水雾化30min;第19天起连续7天腹腔注射NS,200ul/只。模型组于第0,7,14天腹腔注射OVA混悬液200ul/只;第21天起,取OVA溶液10ml,放于雾化器中激发30min;第19天起连续7天腹腔注射生理盐水,其中21天至25天时于激发前30min时进行腹腔注射处理。JTE-013治疗组同模型组一致,于第0,7,14天腹腔注射OVA混悬液200ul/只;第21天起,取OVA溶液10ml,放于雾化器中激发30min;第19天起连续7天腹腔注射JTE-013(2mg/kg),200ul/只;其中21天至25天时于激发前30min时进行腹腔注射处理。RAC1抑制剂组于第0,7,14天腹腔注射OVA混悬液200ul/只;第21天起,取OVA溶液10ml,放于雾化器中激发30min,共激发5天;第19天起连续7天腹腔注射JTE-013(2mg/kg),200ul/只;其中21天-25天时于激发前30min时进行腹腔注射JTE-013处理。RAC1抑制剂组在第0-21天以3 mg/kg剂量给予尾静脉注射。处理24小时后,眼球取血,随后颈椎脱臼处死小鼠,取肺组织及肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。HE 染色及 AB-PAS 染色镜下观察肺组织的病理变化;瑞氏-姬姆萨染色法对BALF中总细胞数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数以及淋巴细胞数进行计数分类;酶联免疫吸附测定法检测BALF中IL-1、IL-4、IL-5的浓度以及血清中IgE浓度;免疫印迹实验检测四组小鼠肺组织中RAC1、JNK以及自噬蛋白Beclin1、LC-3B、P62、P-P62的含量;免疫组织化学染色法检测肺组织中Beclinl、LC-3B、P62在结构中的表达。结果:1.HE染色及AB-PAS染色:模型组气道周围有明显的炎性细胞浸润,气道上皮有明显的杯状细胞增生;给予JTE-013后,JTE-013显著抑制气道炎症的产生以及杯状细胞的含量。2.瑞士-吉姆萨染色:模型组小鼠BALF中总细胞数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞含量均有显著增加,有统计学差异(P<0.01);JTE-013处理后,以上细胞含量明显下降,与模型组相比有统计学差异(P<0.01)。3.酶联免疫吸附剂测定法:OVA诱导的哮喘小鼠BALF中的IL-1、IL-4、IL-5的含量明显增高,而经JTE-013处理后,与模型组比较小鼠BALF中的细胞因子含量降低,其差异具有统计学意义(P<0.01);血清中IgE含量在模型组中含量显著高于正常组,具有统计学差异(P<0.01),经JTE-013处理后,IgE含量降低且具有显著的统计学差异(P<0.01)。4.免疫组织化学染色检测肺组织中自噬相关蛋白的阳性表达:正常组气管结构完整气管壁周围无明显炎性细胞,Beclin-1、LC-3B在气道上皮蛋白表达较少,P62阳性表达相对较多;模型组炎性细胞明显增多,气道上皮中Beclin-1、LC-3B 阳性表达显著增加,而P62蛋白表达含量降低;JTE-013处理后肺组织可见Beclin-1、LC-3B阳性表达均明显减弱,而P62蛋白含量明显增加,且气道周围炎性细胞明显减少。5.Western Blot法检测肺组织中相关蛋白的表达,模型组中RAC1、JNK的含量以及自噬相关蛋白Beclin-1的含量显著增加,LC-3B Ⅰ向LC3BⅡ的转化增强,P62蓄积降低,P62磷酸化表达显著增强(P<0.01);JTE-013显著降低了肺组织中RAC1、JNK的含量以及自噬相关蛋白Beclin-1的含量,并减弱LC-3B Ⅰ向LC3BⅡ的转化,使P62蓄积增加,P62的磷酸化表达降低且与模型组相比具有极显著差异(P<0.01)。给予RAC1抑制剂后,RAC1、JNK的含量以及自噬相关蛋白Beclin-1的含量显著增加,LC-3B Ⅰ向LC3B Ⅱ的转化增强,P62蓄积降低,P62活性显著增强(P<0.01);RAC1、JNK以及自噬相关蛋白表达跟模型组相比含量没有显著变化。结论:1-磷酸鞘氨醇受体2抑制剂JTE-013通过抑制RAC1/JNK通路调节自噬从而抑制哮喘炎症的产生及发展。
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