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胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤,它起源于神经上皮细胞,占颅内原发肿瘤的70%。胶质瘤压迫和破坏所在部位及邻近的脑组织,由于其与正常脑组织无明显界限,手术切除难以达到细胞学上的彻底清除,且术后复发快、复发率高、生存期短,患者的预后极差。膨胀性、浸润性生长是胶质瘤最突出的肿瘤生物学特征,因此,抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移力成为胶质瘤治疗的重要策略。中医理论上认为,人体一切活动,无不依赖于气的推动。升降出入是气的运动形式。当气机升降失于调畅,清气不升,浊气不降,就会产生各种疾病,故有“百病生于气也”的论述。“头为诸阳之会”,气升则浊降。气虚气滞气逆气陷均可表现为气机升降的异常,气机不畅,推动无力,既可血行不畅产生血瘀,又可使津液不能正常输布于周身,凝结成痰,经络阻塞,日积月累则可引起癥瘕积聚。可见,清阳不升,浊阴不降,久居脑室是引起脑胶质瘤发生发展病机中的核心环节之一。微重力状态是克服正常重力的特殊环境,可影响机体的气机升降。那么,模拟微重力(MMG)是否影响胶质瘤细胞侵袭迁移力以及其相关作用机制如何?目前尚无相关报道。基于此,本实验以“中医气机升降”理论为指导,采用“西学中用”思考路线,观察MMG对胶质瘤细胞的侵袭迁移力的影响,并对相关作用机制进行探索。我们的研究有助于为新的胶质瘤治疗策略的探索开辟新视角。实验一MMG对恶性胶质瘤细胞系U87(U87MG)生物学特征的影响1.目的观察MMG对U87MG生物学特征的影响2.方法U87MG分为两组,即正常重力组(NG组)和MMG干预组(MMG组),U87MG分别在NG和MMG条件下培养24h,48h和72h。倒置相差显微镜观察U87MG形态;Hoechst染色法及MTT法检测U87MG增殖情况;细胞划痕实验检测U87MG迁移情况;Transwell侵袭实验检测U87MG侵袭情况;Western Blot法检测基质金属蛋白酶(MMP)-2,-9和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达情况;颅内原位瘤实验检测不同组细胞在体成瘤情况。3.结果(1)MMG对U87MG形态的影响:与NG组相比,MMG处理后,U87MG形态呈现时间依赖性改变,干预72h后,U87MG轮廓不规则,边缘圆钝,触角变少。(2)MMG对U87MG增殖能力的影响:与NG组培养48h,72h相比,MMG组U87MG在培养48h,72h后,细胞密度明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);模拟微重力干预再培养后,MMG组U87MG增殖率降低,以微重力干预48h和72h结果较显著,与NG组比较具有统计学差异(P<0.05)。(3)MMG对U87MG迁移能力的影响:与NG组相比,MMG组U87MG划痕处的聚合面积明显减小,以MMG干预48h和72h结果较显著,与NG组比较具有统计学差异(P<0.05)。(4)MMG对U87MG侵袭能力的影响:MMG组U87MG裂解Matrigel基质胶并侵袭过Transwell小室膜的数量明显减少,且MMG干预24h,48h和72h结果均显著,与NG组比较具有统计学差异(P<0.05)。(5)MMG对U87MG侵袭及恶性程度相关蛋白MMP-2,MMP-9和GFAP蛋白表达的影响:与NG组相比,MMG组U87MG MMP-2和MMP-9蛋白的表达均下调,GFAP蛋白的表达上调,与NG组比较具有统计学差异(P<0.05)。(6)MMG干预对U87MG在体成瘤性的影响:将NG组与MMG组培养72h的U87MG分别进行原位瘤注射,28d后行MRI影像检测发现,与NG组相比,MMG组肿瘤体积明显减小,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.结论MMG干预后,U87MG形态呈现时间依赖性改变;细胞增殖被抑制;迁移及侵袭力减弱;MMP-2,MMP-9蛋白表达下调,GFAP蛋白表达上调;U87MG在体成瘤能力降低。实验二抑制容量性钙内流(SOCE)对U87MG迁移侵袭力的影响1.目的观察抑制SOCE对U87MG侵袭迁移力的影响。2.方法STIM1-sh RNA质粒转染U87MG,Western Blot法检测其干涉效率;活细胞钙成像检测SOCE抑制剂(2-APB和SKF-96365)处理及STIM1 RNAi后U87MG SOCE的改变;细胞划痕实验检测抑制SOCE对U87MG迁移能力的影响;Transwell侵袭实验检测抑制SOCE对U87MG侵袭能力的影响。3.结果(1)U87MG STIM1-sh RNA转染效率:质粒转染U87MG 3 d后,STIM1蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。(2)2-APB、SKF-96365处理及STIM1 RNAi后,U87MG SOCE的改变:TG诱导引起的细胞内Ca2+释放无明显改变,但明显抑制细胞外Ca2+内流(P<0.05)。(3)抑制SOCE对U87MG迁移能力的影响:与对照组相比,2-APB、SKF-96365处理组及STIM1-RNAi组U87MG迁移能力明显被抑制(P<0.05)。(4)抑制SOCE对U87MG侵袭能力的影响:与对照组相比,2-APB、SKF-96365处理组及STIM1-RNAi组U87MG侵袭能力明显被抑制(P<0.05)。4.结论质粒介导的STIM1 RNAi可明显下调U87MG STIM1蛋白的表达;SOCE抑制剂及STIM1 RNAi可明显抑制TG诱导的SOCE,而对TG引起的细胞内Ca2+释放无影响;抑制U87MG SOCE可明显减弱其迁移和侵袭能力。实验三MMG对U87MG SOCE的影响1.目的观察MMG对U87MG SOCE的影响。2.方法U87MG分别在NG和MMG条件下培养72h后,活细胞钙成像检测SOCE的改变;q RT-PCR检测STIM1,STIM2,Orai1及Orai2 m RNA的变化;Western Blot法检测Orai1蛋白表达的改变。3.结果(1)MMG对U87MG SOCE的影响:与NG组相比,MMG组U87MG由TG诱导的SOCE明显被抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),而对细胞内Ca2+释放无明显影响(P>0.05)。(2)MMG对U87MG STIM1,STIM2,Orai1和Orai2 m RNA表达的影响:与NG组相比,MMG组U87MG Orai1 m RNA表达水平下调48.7%,差异具有统计学意义(P<0.05),而STIM1,STIM2,Orai2 m RNA表达水平无明显差异(P>0.05)。(3)MMG对U87MG Orai1蛋白表达的影响:与NG组相比,MMG组U87MG Orai1蛋白表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.结论MMG处理72h后:可以明显抑制TG诱导引起的SOCE;下调U87MG Orai1m RNA及蛋白的表达。实验四MMG通过抑制U87MG SOCE减弱其侵袭迁移力的相关机制研究1.目的研究MMG通过抑制U87MG SOCE减弱其侵袭迁移力的相关机制2.方法pc DNA3.1-Orai1质粒转染U87MG 48h,再于MMG条件下培养72h:Western Blot法检测U87MG Orai1蛋白的表达;活细胞钙成像检测U87MG SOCE的改变;细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测U87MG迁移和侵袭情况。3.结果(1)Orai1过表达对MMG干预引起的U87MG Orai1蛋白表达下调的影响:与正常MMG组相比,Orai1过表达的U87MG经MMG处理后Orai1表达水平明显上调(1.87倍),差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)Orai1过表达对MMG干预引起的U87MG SOCE下调的影响:与正常MMG组相比,Orai1过表达的U87MG经MMG处理后其SOCE恢复至正常水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)Orai1过表达对MMG干预引起的U87MG侵袭迁移力减弱的影响:与正常MMG组相比,Orai1过表达的U87MG经MMG处理后其侵袭迁移力接近正常水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.结论Orai1过表达可拮抗MMG干预引起的U87MG Orai1蛋白表达的下调及SOCE的减少;Orai1过表达可减弱因MMG干预引起的侵袭迁移力的下降。综上,MMG减弱U87MG迁移及侵袭能力,其机制可能与下调其Orai1表达水平从而降低SOCE相关。