禽网状内皮组织增生症病毒(REV)是引发禽网状内皮组织增生症(RE)的病原。RE是一种对禽类危害严重的肿瘤病和免疫抑制病,与马立克病(MD)和禽白血病(AL)并称为三种危害禽类的病毒性肿瘤病。在宿主与病原相互作用过程中miRNA起着重要的作用,大多数miRNA基因位于与肿瘤形成密切相关的脆弱基因位点,在肿瘤发生发展的多个环节中发挥着类似肿瘤癌基因或抑癌基因的关键性作用,研究并分析REV感染细胞内源性miRNA对进一步揭示REV致病的分子机理、发掘细胞抗REV分子靶标具有重要的理论意义与应用前景。鉴于此,本研究利用SPF鸡人工感染模型,选择脾脏组织作为研究对象,因为脾脏是鸡重要的外周免疫器官,是成熟T、B淋巴细胞的定居和免疫应答场所。采用高通量测序技术以及qRT-PCR检测方法,通过鉴定免疫致病相关的主要差异mRNA和miRNA,初步探讨了REV与鸡体在miRNA调控水平上的相互作用。主要研究内容如下:1.本研究使用REV-SNV标准株腹腔注射1日龄SPF雏鸡。分别在7、14、21、28、35和42dpi采集三种主要的免疫器官(脾脏、胸腺和法氏囊),观察临诊症状、记录眼观病变并计算免疫器官指数。结果表明,REV感染SPF鸡后,与对照组相比,感染组雏鸡出现精神萎靡,羽毛凌乱且稀少,食欲减退,体重减轻等症状。剖检见法氏囊和胸腺萎缩、脾脏肿大,同时法氏囊和胸腺指数下降、脾脏指数升高。2.根据REV的gag基因保守序列设计一条特异性探针及引物,建立了TaqMan探针qRT-PCR检测方法。结果显示标准曲线线性关系良好,线性回归方程为Y=-3.4171X+41.92,相关系数R~2=0.9965;特异性良好,仅能检测REV,无交叉反应现象;敏感性良好,最小检出模板浓度约为10 copies/μL,是普通PCR的1000倍;重复性良好,批内、批间变异系数均小于2%。应用该方法,对7、14、21、28、35和42dpi脾脏、胸腺和法氏囊的病毒载量与前病毒载量进行检测,结果表明,在每个时间点均能检测到病毒RNA与前病毒DNA。脾脏、胸腺和法氏囊(前)病毒载量整体趋势一致,均在28dpi检测到最低的(前)病毒载量。除法氏囊在21dpi检测到最高的(前)病毒载量外,脾脏和胸腺均在14dpi检测到最高的(前)病毒载量。3.选取7、14和21dpi的脾脏组织样品,利用高通量测序技术对两组样品进行转录组测序。通过转录组数据分析,获得1507个差异mRNA,其涉及先天免疫反应(TLR、MAD5、TRIM25)、适应性免疫反应(LY6E、CD36、LAG3)、凋亡与自噬(IRF1、PDCD1、WNT5A)和炎症反应(CCL4、TNFRSF18、CDKN2)等。另外模式识别受体、T细胞受体、JAK-STAT、TNF以及NF-kappa B信号通路等在REV感染期间发挥重要作用。最后,通过qRT-PCR验证33个免疫相关mRNA,其表达量与测序数据呈正相关,在三个时间点的相关系数分别为:R~2=0.961、0.9681和0.9467,表明转录组测序结果准确、可靠。4.miRNA表达谱分析结果显示,在7、14和21dpi共获得63个差异miRNA(30个已知miRNA和30新型miRNA)以及7373个候选靶基因。功能富集分析结果表明,miRNA在SPF鸡的不同生长阶段具有重要的生物学功能并在多种类型的信号通路中发挥着重要调控作用。最后,通过qRT-PCR验证15个miRNA,其表达量与测序数据呈正相关,在三个时间点的相关系数分别为:R~2=0.9384、0.9718和0.9788,表明小RNA测序结果准确、可靠。5.miRNA与mRNA的整合分析结果显示,在7、14和21dpi共获得482个差异靶基因,并预测到886个已知miRNA-mRNA作用对和580个新型miRNA-mRNA作用对。功能富集分析结果显示,差异表达靶基因显著富集在免疫相关的信号通路类别中,如免疫系统、细胞生长与凋亡、信号分子和相互作用、信号转导类别。通过qRT-PCR进一步验证14对免疫相关miRNA-mRNA作用对。结果表明,REV感染后miRNA可以调控炎性细胞因子(CCR2、CCR4、CCR8、STAT1)发生变化,并影响T、B淋巴细胞调节因子(CTLA4、CASP10、RAPGEF4)的表达。同时,凋亡因子(FOS、JUN、TNFSF6)和肿瘤调节因子(MAPK10、TNFRSF13C)的表达也发生变化。这些结果拓宽了对REV感染引起免疫抑制和诱导肿瘤发生机制的理解,但其具体作用机制尚需进一步研究。