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目的:系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis,MsPGN)是我国原发性肾小球疾病中最常见的病理类型,其主要的病理变化是弥漫性肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)增生、不同程度细胞外基质(extracellular matrix , E C M)增多。抑制系膜细胞增殖是增殖性肾小球疾病重要的治疗策略。近几年来生命科学研究领域的一个重大突破就是在真核生物体内发现了大量具有调节功能的非编码RNA——microRNA(miRNA),这些小RNA广泛参与到调控生物增殖/凋亡、发育/衰老等病理生理过程中发挥着重要的作用,不仅参与一系列生物功能,还和人类的疾病发生密切相关。成熟的miRNA主要通过直接降解mRNA和抑制蛋白质翻译两种机制来调控靶基因的表达,一个miRNA能够作用于多个具有共同靶序列的mRNA;反之,一个靶基因mRNA可能有多个miRNA的靶结合位点,受多个miRNA的调控,这种miRNA沉默效应的多面性使得细胞能够在多种信号通路中快速转换。目前研究表明,miR-34a可能参与调控多个信号通路而影响细胞的增殖。本课题以miR-34a为切入点,对其下游靶基因(及其相关信号通路)进行研究,阐明miR-34a影响大鼠系膜细胞增殖的机制。方法:1利用留存的抗Thy1抗体,尾静脉注射Wistar大鼠建立抗Thy1系膜增生性肾炎动物模型。检测不同病理时间点miR-34a的表达情况;2将miR-34a模拟物(mimics)或miR阴性对照物(negative control)转染大鼠系膜细胞系(RMC) 48h后,利用MTT方法检测不同时间点(24h,48h,72h)的miR-34a mimics转染组与对照组增殖速率的变化程度;3利用流式细胞仪检测RMC细胞周期变化;4利用在线软件miRGen对miR-34a的下游靶基因进行预测,筛选出与增殖相关的靶基因,并找出关注的靶基因;5检测miR-34a靶基因的mRNA与蛋白表达变化,进一步利用双荧光素酶报告质粒系统检测miR-34a对靶基因表达的调控作用;6 miR-34a mimics或miR-34a negative control转染后,利用real time PCR和western blot检测细胞周期相关蛋白(CDK,CKI)的mRNA及蛋白表达水平的改变;7寻找可能影响细胞周期改变的信号通路,并检测信号通路上关键信号调节因子的表达改变。结果:1利用抗Thy1抗体成功制备了抗Thy1系膜增生性肾炎大鼠模型。检测模型各个时间点肾脏组织中miR-34a表达量的变化,结果表明,miR-34a随增殖加重而降低,并随着病变恢复而回升至基线水平(p<0.05);2 miR-34a mimics和miR negative control转染大鼠系膜细胞系(RMC),与对照组相比,mimics组增殖活性从48h开始明显下降(p<0.05),并且表明,影响的细胞周期主要是阻滞了G0/G1期(使得G0/G1期延长),最终缩短了S/G2/M期;3利用生物信息学软件miRGEN对miR-34a的靶基因进行了预测,根据系膜增殖性肾炎的病理生理特点,重点选择了PDGFR-β(血小板源性生长因子受体-β)。并通过双荧光素酶实验证明,PDGFR-β是miR-34a的直接靶基因(p<0.05);4将miR-34a mimics或miR negative control转染RMC细胞,检测PDGFR-β的表达改变。与miR negative control组相比,miR-34a mimics组的PDGFR-β与p-PDGFR-β的蛋白表达同时下降,具有统计学意义(p<0.05),而PDGFR-β的mRNA水平没有变化(p>0.05),表明,miR-34a可能通过转录后水平对PDGFR-β进行调控;5选取主要调控细胞G0、G1期的周期相关蛋白,CDK蛋白和CKI蛋白进行了检测。将miR-34a mimics或miR negative control转染RMC,48h后,与对照组相比,miR-34a mimics组的cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6的蛋白水平皆下降(p<0.05),cyclin E mRNA水平降低(p<0.05),其余没有变化(p>0.05)。p21蛋白水平下调(p<0.05),mRNA水平上调(p<0.05),p27蛋白水平上调(p<0.05),mRNA水平上调(p<0.05);6检测RAS/MAPK通路上ERK1/2、MEK1的蛋白表达含量。结果表明ERK1/2的总蛋白表达没有变化(p>0.05),而MEK1总蛋白水平下调(p<0.05)。miR-34a mimics组与对照组相比,p-ERK和p-MEK明显下降(p<0.05)。结论:1抗Thy1系膜增生性肾炎大鼠模型中,miR-34a随着病理变化而改变;2 miR-34a可以使RMC细胞增殖活性下降,主要与延长G0/G1期有关;3 PDGFR-β是miR-34a的直接靶基因;4 miR-34a刺激PDGFR-β通过RAS/MAPK通路下调G0/G1期细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E,CDK蛋白CDK2、CDK4、CDK6等蛋白表达,但是其mRNA水平仅cyclinE发生了变化,提示miR-34a的靶基因不仅有PDGFR-β、cyclin D1、CDK4、CDK6,而CDK2也可能是其靶基因,所以mRNA水平没有变化;5 miR-34a可以通过抑制PDGFR-β进而阻滞G0/G1期从而影响细胞增殖,为调控系膜细胞增殖的研究提供了新的思路。