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钙离子是细胞中最广泛和多样化的第二信使。钙调素则是一个小的,无处不在的蛋白质,并作为信号蛋白介导钙离子信号。钙调素可以激活许多酶,包括一氧化氮合成酶,磷酸二酯酶,钙调素依赖性蛋白激酶,钙调素依赖性蛋白磷酸化酶。钙调磷酸酶是由一个催化亚基A和一个调节亚基B组成的异二聚体。尽管它分布广泛,但是它的序列和结构在许多真核生物中非常保守。钙调磷酸酶在T细胞激活,细胞凋亡,心脏肥大中起着重要作用,并且作为细胞内钙信号的一个广泛的载体。钙调磷酸酶的催化亚基包括催化域,调节亚基结合域,钙调素结合域以及一个自我抑制域。在响应钙离子刺激时,钙调素会与钙调磷酸酶结合。钙调素结合于钙调磷酸酶催化亚基上的钙调素结合域,引起催化亚基构象的改变并使自抑制域从催化域中脱落,从而激活其催化活性。钙调素在催化亚基上的结合序列也称作钙调素的结合基序。Yap等人根据钙调素结合基序的结构以及序列信息建立了一个钙调素靶蛋白数据库(http://calcium. uhnres.utoronto.ca/ctdb)。可以用来预测一个序列是否包括钙调素结合域,并分析结合域中氨基酸的亲水和疏水性。许多依赖于钙离子的钙调素结合基序被鉴定为1-14或者1-10家族,数字表示与钙调素结合的关键的疏水氨基酸的位置。目前仍旧缺乏研究这些与钙调素结合的蛋白质中的关键氨基酸的实验证据。本论文以土生隐球酵母菌为材料,研究钙调磷酸酶的催化亚基与CaM的结合特性。该催化亚基由639个氨基酸组成,其分子量约为71kDa。我们通过构建钙调素结合域的截短突变蛋白来确定钙调素结合域的位置,并通过定点突变研究该结合域中的关键氨基酸。本研究中,我们首先将催化亚基的序列提交至钙调素的靶蛋白数据库中,预测钙调素的结合域并分析与钙调素结合的关键氨基酸,并通过实验来证明。主要的研究结果如下：1、首先将催化亚基的序列提交至钙调素的靶蛋白数据库(http://calcium. uhnres.utoronto.ca/ctdb),这个数据库中包括已经报道的大多数与钙调素结合的序列。催化亚基基因编码一个71kDa的蛋白,其钙调素结合域位于其C端。钙调素结合域中保守的疏水氨基酸残基I439,I443,V446以及V452形成1-5-8-14基序,这种基序代表的氨基酸残基可能是与钙调素结合的关键氨基酸残基。I439和F453则是预测的锚定氨基酸残基,这两个氨基酸残基也可能与钙调素结合。2、为了鉴定预测的钙调素结合域的正确性。通过Far-western blotting技术研究删除突变蛋白和定点突变蛋白与钙调素的结合特性。为了鉴定钙调素结合域,我们将催化亚基基因和它的删除突变蛋白转移至硝酸纤维素膜上,验证它们与钙调素的结合特性。删除突变蛋白ACNAb(删除了S454至A639位置)能够与钙调素结合,而删除突变蛋白ACNAa(删除了R436至A639位置)不能够与钙调素结合,因此验证了R436到S454位置为催化亚基上钙调素结合域的位置。3、为了预测钙调素结合域中与钙调素结合的关键的氨基酸残基。我们突变了这5个预测的保守的疏水氨基酸残基I439,I443,V446,V452,以及F453。结果发现未突变的催化亚基蛋白和钙调素的结合程度要强于5个的定点突变的突变蛋白,并且CNAl和CNA2突变蛋白和钙调素的结合量最小,这证明I439和I443是与钙调素结合的关键氨基酸。4、最后通过PNPP法测定CNA和它的突变蛋白的磷酸酶活性的大小。删除了CaM结合域的△CNAa重组蛋白的磷酸酶活力最低。CNA1 (Ile439)和CNA2 (Ile443)的突变蛋白的磷酸酶的活性非常低,说明第439位和第443位的Ile不仅在与CaM的结合中起着重要作用,而且对酶活性的影响也非常大。