研究背景上皮性卵巢癌（卵巢癌）是女性最常见的恶性肿瘤之一，其病死率高居妇科恶性肿瘤之首，由于起病隐匿、早期缺乏特异性症状与体征及有效的医学筛查手段，约70%卵巢癌患者就诊时已发生局部或远处转移，失去了手术的最佳时期，结果导致5年的总体生存率欠佳。究其原因，复发和侵袭转移是影响患者预后最主要的因素。近年的研究表明，恶性肿瘤组织中存在一小群具有干细胞样特性的细胞亚群，具有自我更新、增殖分化和侵袭转移的能力，它们是肿瘤发生、发展、侵袭和转移的根源。如果能研究这群肿瘤细胞发生增殖、凋亡的分子机制，便可靶向性抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡，从而有效防止肿瘤复发。微小RNA（MicroRNA, miRNA）是一类长约18-25个核苷酸(nt)的单链非编码小分子，它们广泛存在于各种动植物中，通过剪切或抑制靶mRNA的翻译，介导基因转录后的负性调控。由于每个miRNA可以调控数十甚至数百个靶基因，因此，这些miRNA几乎对每一条信号通路都具有潜在的影响，它们广泛参与了调控人体的各种生理病理过程。越来越多证据表明，miRNA突变和异常表达与各种人体肿瘤发生、发展相关，miRNA可作为癌基因或抑癌基因而起作用。研究证实，miRNA能抑制或激活多种肿瘤干细胞相关基因的表达。深入研究miRNA在肿瘤干细胞中的表达状况及其功能，对研究肿瘤的发生、发展和转移的机制具有重要意义，并将有利于肿瘤的诊断、预后及治疗。Wang ZX等研究证实在晚期乳腺癌组织中miR-21的表达水平明显升高，miR-21的高表达是乳腺癌患者预后不良的独立预测指标，miR-21影响乳腺癌患者预后的机制目前尚不明确。人类miR-21定位于染色体17q23.2区，在乳腺癌中己证实miR-21通过抑制Ki-67基因的表达，在结肠直肠癌细胞中miR-21过度表达，其抑制RhoB基因表达，在恶性胶质瘤中miR-21过多表达，下调PDCD-4基因，在宫颈癌HeLa细胞中，miR-21通过下调PDCD-4基因，通过这些途径miR-21促进癌细胞的增殖。在胶质瘤中，抑制miR-21表达，通过激活半胱氨酸蛋白酶9和3来诱导瘤细胞的凋亡，在胰腺癌中，miR-21通过上调Bcl-2基因从而抑制癌细胞的凋亡。在结肠直肠癌细胞中miR-21过度表达，其抑制RhoB基因表达，通过这些从而抑制癌细胞的凋亡，但在卵巢癌肿瘤干细胞中miR-21的作用及可能的作用途径尚不清楚。研究目的本课题组前期研究中，应用microarray芯片技术检测了CD133/1+和CD133/1-细胞的miRNA表达谱，与CD133/1-细胞相比，miR-21在CD133/1+细胞中的表达下降，本研究选取miR-21表达下降的CD133/1+细胞为研究对象，试图探讨miR-21对CD133/1+卵巢癌干细胞增殖及凋亡的作用，从而为以肿瘤干细胞为靶向的、新型的卵巢癌基因治疗提供一定的实验依据。研究方法1)流式细胞术分选CD133/1+卵巢癌干细胞：人卵巢癌细胞株OVCAR3在高糖型DMEM培养基中培养至对数生长期，胰酶消化，制备成单细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度，流式细胞术分选CD133/1+和CD133/1-细胞。2)观察成熟miR-21在CD133/1+和CD133/1-细胞的表达水平：收集上述分选的CD133/1+和CD133/1-细胞，Trizol提取总RNA，茎环法逆转录成cDNA，采用SYBR Green染料相对实时定量测定miR-21表达水平，以U6为内参。3) MTT实验：利用Lipofectamine2000将人工合成的miR-21-mimics瞬时转染CD133/1+细胞，并设无关序列转染组及空白转染组，MTT实验检测各转染组细胞增殖能力。4) EdU实验：利用Lipofectamine2000将人工合成的miR-21-mimics瞬时转染CD133/1+细胞内，并设无关序列转染组及空白转染组，应用EdU试剂盒直接测定细胞内DNA的变化快速统计处于S期的细胞百分数，分析细胞增殖情况。5)．线粒体膜电位测定利用Lipofectamine2000将人工合成的miR-21-mimics瞬时转染CD133/1+细胞，并设无关序列转染组及空白转染组，应用罗丹明123（Rhodamine123）检测线粒体膜电位，分析细胞凋亡情况。6)．细胞凋亡检测利用脂质体Lipofectamine2000将人工合成的miR-21-mimics瞬时转染CD133/1+细胞，并设无关序列转染组及空白转染组，应用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit）直接测定细胞凋亡率。7)统计学分析：计量资料采用均数±标准差表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1．在OVCAR3细胞系中CD133/1+的细胞占0.3%。2．与CD133/1-细胞相比，成熟型miR-21在CD133/1+细胞中的表达明显下降（1.00±0.00vs2.16±0.25，P=0.015）。3．MTT检测显示，在miR-21处理组中OD值明显降低，与无关序列组及空白对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），无关序列组与空白对照组之间，差异无统计学意义（P>0.05）。4．miR-21对CD133/1+卵巢癌干细胞增殖的影响：EdU实验结果显示，CD133/1+卵巢癌干细胞处于增殖期的细胞数在miR-21处理组中是48.0±5.3个，无关序列组及空白对照组增殖期的细胞数分别为117±6.4个、122±4.9个。三者的增殖率分别为30.4%,47.5%,48.6%，miR-21转染组与无关序列及空白对照组相比，miR-21处理组细胞体外增殖能力明显下降（P<0.05），无关序列组与空白对照组相比无差异（P>0.05）。5.罗丹明(Rhodamine)123荧光探针FCM分析结果证实：实验组CD133/1+细胞线粒体膜电位相对荧光强度分别为85137±276；阴性对照组CD133/1+细胞线粒体膜电位相对荧光强度分别为98365±362；空白对照组CD133/1+细胞线粒体膜电位相对荧光强度分别为98887±259，实验组与空白组、阴性组比较有统计学差异(P<0．05)，空白组与阴性组间比较无统计学差异(P>0．05)6．Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测结果示，CD133/1+卵巢癌干细胞在miR-21处理组中的凋亡率是16.7%，无关序列组及空白对照组的凋亡率分别为9.7%，9.3%，与无关序列及空白对照组相比，增加CD133/1+细胞内miR-21的含量细胞凋亡率明显增加（P<0.05）。结论:1．在卵巢癌OVCAR3细胞系中存在少数的CD133/1+卵巢癌干细胞，成熟型miR-21在CD133/1+卵巢癌干细胞中的表达下降。2．增强miR-21在CD133/1+细胞中的表达，能明显抑制CD133/1+细胞的增殖。3．增强miR-21在CD133/1+细胞中的表达，能明显诱导CD133/1+细胞的凋亡。