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内皮细胞间质化(Endothelial to mesenchymal transition,EndMT)是指在器官发育以及多种病理状态下,内皮细胞(endothelial cell,EC)丢失部分自身特征,获得某些间质细胞的表型,同时发生一些功能改变。EndMT是纤维化的诱导因素,心肌纤维化,肾纤维化病变处的成纤维细胞很大一部分是由内皮细胞经EndMT转变而来。多种因素均可以诱导EndMT,而EndMT参与器官的纤维化、肿瘤的浸润转移等等。血管新生是组织脏器发育过程中的一个重要环节。血管新生的第一个迹象出现在胚胎发育的早期,即中胚层来源的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)分化为成熟的内皮细胞,经过不断的分裂、增殖形成一个初始的血管网络。血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)在这一过程中发挥着关键的作用,诱导内皮细胞增殖和迁移。这种原始的血管结构,也被称为初级毛细血管丛,为了建立一个成熟的循环网络,初级毛细血管丛需要进一步被重塑,改造。在成人中,血管新生主要存在于生理性子宫内膜修复、损伤组织和器官生长、炎症反应、恶性肿瘤等。大多数情况下内皮细胞是稳定的几乎处于静止状态,而当损伤,炎症反应等病理刺激后,各种细胞因子分泌增多,促血管生成和抗血管生成之间的平衡被打破,内皮细胞分裂、增殖、迁移最终形成新生血管。血管新生包括生理性(包括组织损伤修复,子宫内膜修复等)和病理性血管新生(炎症反应,恶性肿瘤)。血管新生与多种疾病的发生发展有关,深入的研究血管新生的机制,有利于临床相关疾病的诊治。本研究分为以下三部分:第一部分:TGF-β1诱导EndMT的实验条件探讨及表型鉴定目的:通过TGF-β1在体外诱导脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)发生间质化改变,并对表型进行验证,为后续实验提供合格的工具细胞。方法:TGF-β1是引起内皮细胞间质化的最重要的因子,我们在体外用TGF-β1(连续刺激5天)诱导HUVECs发生间质化改变。分别通过实时定量聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,q-PCR)以及免疫印迹试验(Western-blot)检测细胞表面标记蛋白的改变。结果:细胞形态改变通过倒置显微镜观察,正常HUVECs排列规则,呈铺路石样,连接紧密。TGF-β1刺激后细胞分布紊乱,形态变为细长,触角增多,细胞间连接松散,可见类似平滑肌细胞样的细胞。Smad3蛋白磷酸化(phosphorylation of Smad3,p-Smad3)是TGF/Smad信号通路活性的一个检测指标。我们通过Western-blot检测不同浓度的TGF-β1引起Smad3蛋白磷酸化的改变。结果显示TGF-β1浓度为1 Ong/mL时p-Smad3升高最明显。通过q-PCR及Western-blot我们在RNA及蛋白水平均检测到内皮特异性标记物:CD31,VWF表达降低,间质细胞特异性标记物:α-SMA表达增高,提示HUVECs发生间质化改变。结论:TGF-β1(10ng/mL)连续刺激5天可以成功诱导HUVECs发生间质化改变。第二部分:TGF-β1对内皮细胞成血管功能的影响目的:探讨TGF-β1对内皮细胞成血管,增殖以及迁移功能的影响。方法:通过体外成血管实验,划痕实验,Transwell实验以及CCK8实验对TGF-β1刺激后内皮细胞成血管,迁移以及增殖功能进行检测。结果:HUVECs在基质胶中可以通过分裂增殖形成条索状的结构,在镜下横断面显示为环状的结构。我们在基质胶中种入相同细胞数的HUVECs以及TGF-β1刺激后的HUVECs。结果显示:TGF-β1刺激后,HUVECs在基质胶中形成较多的环状物,提示TGF-β1促进HUVECs生成较多的毛细血管。通过划痕实验,分别在在0h,12h,24h观察细胞迁移的距离。结果显示:TGF-β1刺激后HUVECs迁移能力增加。同时通过Transwell实验也证实了在TGF-β1刺激后HUVECs向下室迁移的细胞数目增多。CCK8细胞增殖检测结果显示:TGF-β1刺激后HUVECs在490nm处吸光度更强。结论:添加TGF-β1刺激后内皮细胞成血管功能增强,同时细胞迁移以及增殖能力提高。第三部分TGF-β1诱导EndMT促进血管新生的机制研究目的:探讨TGF-β1诱导EndMT促进血管新生的分子机制,方法:血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor VEGF)是促进血管新生最重要的细胞因子。我们通过q-PCR检测了 VEGF和血管内皮细胞生长因子受体 2(vascular endothelial cell growth factor receptor 2 VEGF-R2)RNA 水平的改变。利用Elisa试剂盒检测了细胞培养上清液中VEGF浓度。为了探讨EndMT在TGF-β1促进血管新生中的作用,我们利用TGF-β/Smad3信号通路抑制剂Oxymatrine抑制内皮细胞间质化后,通过体内及体外实验检测细胞成血管能力的改变。最后利用AKT磷酸化的抑制剂HY15186抑制AKT磷酸化后,观察细胞成血管功能的改变。结果:TGF-β1刺激HUVECs后,VEGF及VEGF-R2表达增高。而抑制EndMT后TGF-β1促血管新生功能减弱。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,通过Western-blot我们发现TGF-β1刺激后,HUVECs中p-AKT表达明显增加。同时在加入AKT磷酸化的抑制剂HY15186后,TGF-β1促血管新生功能明显减弱。结论:TGF-β1通过上调VEGF/VEGF-R2促进血管新生。抑制EndMT减弱TGF-β1的促血管新生作用。AKT磷酸化参与了EndMT促进血管新生的过程。