光作为能量与信息的携带者,不仅可以通过光合作用转化为化学能,为生物体提供能量,还可以通过感光受体对生物体的生理过程进行调节。蓝细菌作为光合作用的模式生物,主要由藻胆体捕获光能。为了提高光合效率,蓝细菌在长期的自然选择过程中进化出了一套由蓝细菌光敏色素识别和响应,从而调节藻胆体重构的机制。在藻胆体中,有一种核膜连接蛋白(ApcE),作为藻胆体的能量传递终端,特征吸收峰及荧光峰均比其他藻胆蛋白更为红移,这种特性使得其进化为近红外荧光探针具有一定的优势。而蓝细菌光敏色素(CBCR)可以响应光的变化,这使得其适合发展成为光控开关探针。在普通的蓝细菌中,共价连接藻蓝胆素的核膜连接蛋白(ApcE1)最大吸收峰在660 nm,最大荧光峰在675 nm。近期发现了一类可以利用近红外光进行光合作用的蓝细菌,并在这类蓝细菌中发现了吸收峰大于700 nm,荧光峰大于710 nm的组分。Synechococcus sp.PCC7335就属于这类蓝细菌。通过序列比对,在这个藻中找到了一个没有保守性半胱氨酸的核膜连接蛋白(ApcE2),可能与红移的组分有关。为了证实其特征吸收峰及特征荧光峰是否发生红移,将其N端结合色素的结构域(1-273)克隆至表达载体并与产生色素PCB、PEB、PФB的色素合成酶在大肠杆菌中进行共表达,产生的色素蛋白的最大吸收峰分别在700 nm、615 nm和711 nm,最大荧光峰分别在714 nm、628 nm和726 nm,相比较典型的ApcE1,特征峰均红移了近40 nm。由于双体的PCB-ApcE2(1-273)与之后经过截短的单体PCB-ApcE2(24-245)最大吸收峰均在700 nm,最大荧光峰均在714 nm,因此排除了激子耦合而引起光谱红移的可能性。经过酸性尿素变性实验、蛋白胶的醋酸锌染色及氯仿萃取实验,证明了光谱的红移主要是由于色素与蛋白的非共价连接,进而保留了色素△3,31间的双键,使得共轭双键的长度增长导致的。这种不需要裂合酶的催化、非共价的色素化为近红外荧光团的开发提供了新的思路。为了验证ApcE2作为荧光探针的潜力,将色素合成酶的基因与ApcE2构建到一个质粒上进行标记,在大肠杆菌中得到成功运用。为了进一步将其优化成近红外荧光探针,对ApcE2进行了定点诱变,得到了可以非共价连接胆绿素的诱变体,使最大荧光峰更进一步红移至730 nm。为了拓展应用范围,尝试通过体外添加色素与体内合成色素两种方式提供发色团,在动物细胞内进行表达,虽然没有检测到荧光,但这些工作为下一步优化研究奠定了基础。Chr.thermalis PCC 7203也是一种可以利用近红外光进行光合作用的藻,通过序列比对我们发现了一个别藻蓝蛋白ApcF2,其与前面研究的ApcE2类似,也没有保守半胱氨酸。为了检测其光谱性质是否适合作为近红外荧光探针,在大肠杆菌中共表达ApcF2和合成色素的酶,产生的色素蛋白PCB-ApcF2最大吸收峰在674 nm,最大荧光峰在700 nm,酸性尿素变性实验证明了色素与蛋白的连接亦是非共价的。为了进一步将其开发为近红外荧光探针,对蛋白不保守的N端氨基酸进行了缺失,结果发现双体的ApcF2也可以变为单体,并发现N端截短的氨基酸在保持蛋白的活性及色素的稳定性方面存在重要作用。相比较ApcE2,ApcF2在进化为近红外荧光探针方面更具优势:ApcF2分子量更小,且蛋白可溶性非常好,在较宽的pH范围内依然保持较高的活性,故运用范围更广。在本章实验中,还对大肠杆菌的膜进行了标记,并运用荧光显微镜观察到了荧光,这为下一步在动物细胞中的标记奠定了基础。在对ApcF2(20-169)进行随机诱变的实验中,我们得到了光谱蓝移、荧光量子产率更高的诱变体,这为更进一步进行双色标记提供了原材料。近年来,将光敏色素作为光受体来构建光遗传学工具的研究越来越多。由于动物组织对可见光的不可透性及红外线的强烈衰减性,使得对远红及近红外光响应的光受体越来越受重视。本研究中,我们从来源于Synechocystis sp.PCC6803中的蓝细菌光敏色素1393gaf3出发进行分子进化,尝试寻找到对远红及近红外光响应的诱变体。通过对诱变位点及光谱的分析,找到了有关于光谱变化及保持蛋白活性的关键位点,为进一步的研究奠定了基础。