在植物细胞中,DNA遗传物质不仅存在于细胞核内,也存在于叶绿体中。传统的细胞核遗传工程存在诸如基因沉默、失活、位置效应、多基因同时转化困难、花粉漂移等弊端,而作为新型转基因途径的叶绿体转化技术可有效克服常规核转化中的诸多不足。利用同源重组机制,叶绿体转化技术可将外源基因定点整合到叶绿体基因组中,有效地避免位置效应等基因沉默难题。叶绿体基因组自身的原核结构、高拷贝数和母系遗传等特点,为外源基因获得高效表达提供了平台,而且外源基因不会随花粉扩散造成环境污染。目前,双子叶植物尤其是烟草的叶绿体转化技术已经非常成熟,并且在生物反应器方面具有重要的应用价值。但在单子叶植物水稻中,该技术尚未得到有效应用。水稻(Oryza sativa L.)作为全球最重要的谷物之一,与人类的生活密不可分。叶绿体转化技术这一新兴的育种手段在水稻中的建立,将为实现农业的可持续发展提供帮助。本文开展了水稻的叶绿体遗传转化研究,尝试建立水稻叶绿体转化的标准程序,主要内容如下：1.利用6种常用的基因工程试剂测试水稻愈伤组织的敏感性,确定了以潮霉素、氯霉素和草丁膦为筛选压力,其抗性基因hpt、CAT和bar基因为选择标记基因,来构建水稻叶绿体遗传转化系统。2.以水稻9311叶绿体基因组序列trnl-trnA为同源重组序列,烟草叶绿体调控元件5’16SrRNA为启动子,烟草叶绿体3’psbA为终止子,以增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)为报告基因,构建水稻叶绿体荧光表达载体。其中,在EGFP基因的上游5’端设置了一系列不同的Leader序列(其mRNA可与核糖体结合)。在大肠杆菌原核系统中,分析了这一系列不同的Leader调控序列对EGFP基因表达的影响。结果表明,Prrn启动子需在Leader序列的辅助下才能使EGFP基因得到表达,而单独的Prrn启动子不能启动EGFP基因的表达。通过测量大肠杆菌的荧光值,发现Prrn启动子在T7g10Leader序列配合下获得的荧光值最高。荧光强弱顺序为：Prrn+T7g10Leader> Prrn+rbcL Leader>Prrn+atpB Leader>Prrn+psbA Leader>Prrn+RBS>Prrn。选择在大肠杆菌中荧光表达最强的水稻叶绿体荧光载体pUIPEBA7(trnI-Prrn-T7g101-EGFP-TpsbA-trnA),对洋葱表皮细胞和杜氏盐藻细胞进行基因枪轰击,报告基因EGFP在洋葱表皮细胞和杜氏盐藻叶绿体中得到瞬时表达,证实了该载体上的调控元件和基因枪转化方法的适用性。3.在水稻叶绿体荧光载体pUIPEBA7的基础上,分别加入了hpt基因、CAT基因、bar基因3个标记基因,分别得到3个水稻叶绿体遗传转化载体pCTE04, pCTE05和pCTE06,并对4个水稻品种的幼胚和愈伤分别进行基因枪轰击。对T0代转化植株进行分子检测,PCR和Southern blot结果证实pCTE04载体上的hpt和EGFP基因成功整合到水稻TP309叶绿体基因组的trnI-trnA位点。对T1代转化植株进行RT-PCR检测,表明hpt和EGFP基因在叶绿体中得到转录水平上的表达,共聚焦荧光扫描显微镜检测到EGFP基因在叶绿体中表达出绿色荧光。上述结果表明,以潮霉素作为筛选压力建立了水稻叶绿体遗传转化系统。4.尽管hpt和EGFP外源基因在叶绿体中得到表达,但是未能获得同质化植株,而且水稻的叶绿体转化效率很低。针对这一问题,我们在水稻核转化中,加入Co60γ射线辐照处理,探讨辐射对基因枪转化效率的影响。结果表明轰击后的愈伤经过适宜剂量的γ辐射处理,转化频率得到提高。其中,30Gy剂量处理后的愈伤转化效率比未辐射愈伤的转化效率高出2倍。在后期水稻叶绿体转化体系的优化中,将加入Co6γ辐射处理,以期能够提高叶绿体转化效率。