研究背景神经病理性疼痛是指由躯体感觉神经系统损伤或疾病所引起的疼痛。躯体感觉神经系统的损伤是神经病理性疼痛最常见的诱发因素;躯体感觉神经系统的损伤发生以后,其结构和功能随之发生多种慢性、病理性改变,最终导致机体对伤害性和非伤害性刺激信号的病理性放大,即发生神经病理性疼痛。与其他类型的慢性疼痛相比,神经病理性疼痛在发病机制、诊断及治疗等方面均有明显的不同。神经病理性疼痛发病机制的核心为:躯体感觉神经系统的病理性改变导致传入脊髓和大脑的感觉信号发生异常变化和紊乱。“可塑性适应不良”是神经病理性疼痛发病的基础。就其自身特点而言,神经病理性疼痛可视为神经系统的一种独立疾病,与其原发致病因素并无直接相关性。神经病理性疼痛发病相关的解剖结构也极其复杂,涉及整个疼痛感受通路:从周围神经到背根神经节(Dorsal Root Ganglion,DRG),再到脊髓,最终至大脑,贯穿整个神经系统。这些解剖结构既可发生结构性的变化,也可发生功能性的变化。神经病理性疼痛的症状复杂多变:可以表现为对伤害性刺激的反应过度(痛敏),也可在无伤害性刺激的情况下出现自发性疼痛(自发痛),甚至对非伤害性刺激也产生痛觉(触摸痛)。神经系统内多种病理变化参与神经病理性疼痛的病理过程,并导致了上述复杂的临床表现形式。这些病理改变包括:异位动作电位的产生、突触传递的增强和突触性抑制的解除、突触连接的减少、新突触回路的形成、神经免疫调节的异常等等。神经病理性疼痛的共同特征包括触摸痛、痛觉过敏和自发性疼痛。其中,触摸痛是神经病理性疼痛的特征性表现。此外,疼痛是一种主观感受,神经病理性疼痛的临床诊断和标准动物模型的制备十分困难。神经病理性疼痛对患者的日常生活活动能力产生严重的不良影响。基于DN4评分调查(Douleur Neuropathique 4 questions)的多变量分析也进一步证实,无论疼痛的严重程度如何,神经病理性疼痛本身即可对受试者的生活质量有显著不良影响;无论是身体功能相关的评分,还是精神状态相关的评分均较低。随着人口的社会老龄化、糖尿病发病率和癌症发病率的不断增加以及化疗药物使用的不断增加,神经病理性疼痛的发病率将不断上升。目前,神经病理性疼痛的一线治疗药物包括三环类抗抑郁药、普瑞巴林和加巴喷丁。上述药物往往侧重于症状的治疗,并没有针对疼痛的潜在机制进行处理;往往仅能暂时缓解疼痛,且只对少数患者有效。概括而言,病因学和症状学为基础的临床治疗策略没有抓住神经病理性疼痛的本质特征,即神经病理性疼痛是神经系统可塑性异常的一种表现:这些治疗措施没有对神经系统可塑性异常进行干预。这些治疗也没有针对神经病理性疼痛发展的不同阶段,采取不同的治疗措施。基于神经机制的疼痛治疗概念正在兴起,并有望在神经病理性疼痛的治疗中发挥重要作用。间充质干细胞(MSCs)是基质干细胞的一个亚群,可从多种成人组织中分离得到。间充质干细胞有良好的基因稳定性、易于体外扩增、可长时间存储的特性。随着间充质干细胞调节先天免疫系统作用的直接证据越来越多,间充质干细胞移植越来越被认为是一种有前途的细胞治疗手段,尤其适合于免疫相关疾病的治疗,如移植物抗宿主病、神经病理性疼痛等。研究显示,骨髓间充质干细胞经鞘内注射至胸腰椎脊髓脑脊液(CSF)内具有良好的安全性,并且具有更高的组织特异性、更少的全身副作用以及更小的剂量需求(以植入的细胞总数为准)。然而,就神经病理性疼痛的治疗效果而言,鞘注骨髓间充质干细胞的疗效存在极大的差异,既有持续数周的症状显著改善,也有细微到可忽略不计的神经病理性疼痛相关动物行为学的改变。这些相互矛盾的结果表明,我们对骨髓间充质干细胞对神经病理性疼痛的作用及其机制缺乏透彻理解。因此,我们需要对鞘注骨髓间充质干细胞在神经病理性疼痛中的作用及其机制进行深入的研究,以充分优化其镇痛应用。小胶质细胞是中枢神经系统内主要的、固有的免疫细胞,通常位于神经元和其他胶质细胞的周围。作为一种先天免疫细胞,小胶质细胞对中枢神经系统的正常发育至关重要,同时也在整个生命周期中积极维持中枢神经系统的健康。越来越多的证据表明,小胶质细胞既在发育过程中负责突触的清除;同时也在成体中枢神经突触的可塑性中发挥至关重要作用。小胶质细胞在“静息”状态下也十分活跃,通过快速移动的突触和伪足动态监测其周围微环境的变化。小胶质细胞可迅速改变其功能状态以适应机体的生理需要或病理生理性改变。神经系统的任何病理变化或平衡状态的改变均可激活小胶质细胞。当小胶质细胞被激活时,可表现出多种功能状态:既可以发挥保护性的作用,也可能有导致伤害性损伤的作用。小胶质细胞的激活过程是高度多样化的,取决于小胶质细胞所处的体内环境和病理变化的类型。神经细胞同小胶质细胞间的信号交通是小胶质细胞激活的关键。嘌呤能信号是神经系统各细胞间通讯最常用的机制,在多种类型的神经元间、所有类型的胶质细胞和血管细胞之间的通讯,均发挥重要的作用。越来越多的证据表明:神经损伤后脊髓小胶质细胞发生激活反应,并经历一系列显著的变化,直接影响神经病理性疼痛状态的建立。P2X4R是第一个被发现的周围神经损伤后在脊髓小胶质细胞中特异性表达的分子,P2X4R在神经病理性疼痛中发挥至关重要的作用。重要的是,抑制P2X4R和P2X4R调节分子的功能或表达,可调节脊髓背角神经元的异常兴奋、缓解神经病理性疼痛。这些发现表明,P 2 X 4 R阳性的小胶质细胞是神经病理性疼痛机制的核心参与者。因此,小胶质细胞P2X4R是治疗慢性疼痛状态的一个潜在靶点。针对P2X4R及其信号转导机制进行干预为神经病理性疼痛治疗提供了新途径。骨髓间充质干细胞和小胶质细胞均可影响神经病理性疼痛,骨髓间充质干细胞治疗的机制是否涉及小胶质细胞的调节仍是一个未知数。另外,本课题组既往的研究表明,CCD后大鼠DRG神经元内TRPV4的表达上调;TRPV4参与神经病理性疼痛的外周和中枢敏化机制;TRPV4也参与了CCD大鼠背根神经节神经元异位放电。TRPV4是否参与到骨髓间充质干细胞的镇痛机制当中也值得进一步的研究。实验步骤及方法1)观察鞘内注射间充质干细胞对大鼠背根神经节持续受压所致神经病理性疼痛的治疗作用,观察鞘内注射骨髓间充质干细胞的安全性。2)观察骨髓间充质干细胞鞘内注射后,细胞在脊髓内的迁移,并对其镇痛机制进行初步的探讨。3)观察小胶质细胞在CCD造模大鼠神经病理性疼痛发病机制中的作用;骨髓间充质干细胞对CCD模型脊髓小胶质细胞是否存在免疫调节作用。4)P2X4表达的调节是否参与到骨髓间充质干细胞的治疗作用机制中。5)观察DRG内的TRPV4是否参与到骨髓间充质干细胞的镇痛机制当中。统计学分析以上所有数据采用均数±标准差(mean±SEM)的方式表示,利用广义线性模型、重复测量、LSD事后校正多重比较、单因素方差分析(one-way factorial analysis of variance,ANOVA)或学生t检验等方法进行差异性分析,检验各组间的差异是否具有统计学意义。P<0.05为差异有统计学意义。以上统计学过程均使用SPSS软件17.0版(SPSS,Chicago,IL,USA)进行。GraphPad Prism软件5.00版本(GraphPad software,San Diego,CA,USA)用于数据图片的制作。实验结果1.鞘内注射骨髓间充质干细胞可有效缓解大鼠的神经病理性疼痛。CCD术后第4天开始,CCD组大鼠手术侧的肢体表现出显著的机械性痛敏行为一一缩爪反射次数明显增加。结果表明CCD模型可以可靠地模拟神经病理性疼痛的特征性症状:触摸痛。与对照组CCD大鼠相比(CCD+PBS),鞘注骨髓间充质干细胞组(CCD+BMSC)大鼠在鞘注后1天即表现出机械性痛敏的显著减轻:缩爪反射次数明显减少。结果表明鞘内注射骨髓间充质干细胞(BMSC)可显著减缓CCD诱导的神经病理性疼痛,但其作用时间较为短暂。2.骨髓间充质干细胞鞘内注射对生理性疼痛(Nociceptive pain)无异常影响。加速滚轴试验的结果也显示:鞘注前后,大鼠的运动协调性无异常改变。3.骨髓间充质干细胞鞘注组大鼠在注射后1天,腰膨大周围显示出明显的荧光信号,最大的荧光强度位于注射点的位置。冰冻切片的结果显示:脊髓和DRG内未找到经荧光染色的间充质干细胞;也就是说经鞘内注射的骨髓间充质干细胞并未迁移到脊髓内或DRG神经元内。4.与注射前相比,鞘注骨髓间充质干细胞的裂解液均可显著减轻CCD诱导的机械性痛敏。骨髓间充质干细胞裂解液在一定程度上缓解了神经病理性疼痛,其效果与鞘注骨髓间充质干细胞的作用相似。5.骨髓间充质干细胞裂解液可明显缓解鞘注小胶质细胞所诱导的机械性痛敏,即骨髓间充质干细胞的镇痛作用同小胶质细胞存在相关性。6.CCD术后,小胶质细胞激活的标志物Iba-1和0X42的表达均增高,即小胶质细胞的激活与CCD手术后的神经病理性疼痛的发生存在相关性。但鞘注骨髓间充质干细胞对小胶质细胞激活标记物的表达没有影响。即鞘注骨髓间充质干细胞的镇痛作用,与小胶质细胞的激活状态无关。7.免疫印迹和免疫组化的结果显示,骨髓间充质干细胞可抑制体内和体外小胶质细胞P2X4R蛋白表达的上调。8.药理学的干预手段证实,小胶质细胞P2X4R表达的抑制是骨髓间充质干细胞发挥镇痛作用的必要条件。9.免疫印迹和免疫组化的结果显示:CCD组大鼠与BMSC组大鼠间,DRG内TRPV4蛋白的表达无明显差异。鞘内注射骨髓间充质干细胞对DRG神经元TRPV4的表达无影响;TRPV4与BMSC的镇痛无相关性。结论及意义我们的研究结果提示,鞘注骨髓间充质干细胞是一种有效且安全的神经病理性疼痛治疗方法。我们的研究揭示了鞘注骨髓间充质干细胞发挥镇痛作用的新机制,其镇痛效应与移植细胞的归巢无关;骨髓间充质干细胞释放的可溶性因子可能是机械性痛敏得到改善的上要原因;对P2X4R表达的调节是间充质干细胞发挥镇痛作用的重要机制,骨髓间充质干细胞的镇痛作用在很大程度上是通过抑制小胶质细胞P2X4R的表达实现的。骨髓间充质干细胞的镇痛机制与DRG神经元内TRPV4的表达无相关性。随着间充质干细胞为基础的神经病理性疼痛治疗策略的深入研究,针对神经病理性疼痛的多靶点的联合治疗更值得期待。